利用煤的有机化合物发酵产生次生生物气,增强了煤层的储层能力。培养营养对改善煤层的营养缺乏具有重要作用,可促进生物降解过程。考察了有机输入和阳离子浓度对生物甲烷产量的影响。对有机基质影响的研究表明,除酵母浸膏外的传统有机原料应禁止使用,酵母浸膏的输入也应限制在1.00g/L。此外,研究表明,钠、钾、镁、钙和氨氮的离子浓度也影响甲烷和二氧化碳的产量。研究了钙的最佳浓度2 +K+, Na+、镁2 +分别为5.1、1.7、23和1.3 mmol/L。Mg2 +对抑制CH4代谢过程主要为气-煤产甲烷联合体。
厌氧细菌;Bio-methane;煤炭;文化媒体;有机基体
在过去的10年里,对天然气的需求有了巨大的增长。特别是,利用生物技术强化煤层气是利用地下厌氧消化处理提高石油矿床和煤层甲烷产量的理想方法[2,3]。在适当的营养补充下,产甲烷菌群具有将煤中的有机化合物降解为甲烷的潜力。这样可以提高天然气储量和产能,同时也可实现生物气二次生成[4-6]。
以往关于生甲烷微生物性状和生物产甲烷发酵特性的研究主要集中在煤层微生物群落的生物降解过程[2,7,8]。阴离子研究发现,当煤层水体盐度较低(<2 mol/L Cl)时,甲烷生物合成过程可能活跃?)和低SO42 -浓度(<10 mmol/L)[9]。大气水提供的养分在产甲烷微生物代谢中起着重要作用[10,11]。然而,大部分煤层都存在营养不良。煤中的大多数有机化合物不能轻易地用作产甲烷微生物的营养物质。除了煤层中固有的元素外,补充的营养物质对弥补营养不足和促进微生物生长也很重要[12,13]。如果补充营养素浓度过高,产甲烷菌群将受到不利影响[14]。本报告的目的是确定微生物群落培养的最佳营养剂量。甲烷产率和二氧化碳产率是评价实验结果的指标。
材料
本研究所使用的煤和煤层水样均采自老虎台组103#位于中国沈阳的煤层(GPS坐标41.830256,123.957639)。fm103的深度#气煤样为550 m,煤层厚度为6 ~ 18 m。老虎台矿位于抚顺东部,靠近辽宁沈阳,于1901年开矿。截至2004年,该矿可采煤炭储量5560万吨。样本由煤炭资源与安全开采国家重点实验室采集。这些实地研究没有涉及濒危或受保护物种,而且只使用了少量的样本量。这些地点的样本收集和研究不需要特定的许可。
煤样取自掘进工作面新暴露煤层,采用带氮保护的ASTM D 4596-86通道取样法。从fm103中选取了两个样本点#煤层。这些样品被密封在气密钢罐中,并设置气密阀(J&D技术公司制造),使惰性气体冲洗罐,并立即用氮气保护。用于微生物群落来源的煤在无菌台架上被粉碎成小块(直径10- 15mm)(晶雪科技制造)。氮保护被用来维持煤在一个连续的厌氧环境。样品被密封在一个灭菌气体解吸罐(J&D技术公司制造)中,解吸吸收的气体,直到在25℃的大气压力下没有气体解吸。
fm103水样的形成#煤层收集在同一煤层的无菌玻璃瓶中(由费雪科学公司生产),玻璃瓶被灌满以防止氧气进入。煤层水(<收集24小时后)在121℃下蒸压45分钟,密封在无菌玻璃瓶中。注入氩气以密封瓶子的顶部空间。煤层气水样在4℃下保存不超过3天。
文化
试验选取了MAC-1、MAC-2、MAC-3、MAC-4和MAC-5 (MAC为“有机基质影响试验及注意”的缩写)5种不同的营养培养基[4,17]。化合物的最终浓度(g/L)如表1所示,并加入0.1 mL/L的再青嘌呤作为氧指示剂。酵母提取物由Fisher BioReagents生产,其他化学物质由Acros Organics提供。
文化传媒 |
醋酸钠 |
葡萄糖 |
牛肉膏 |
酵母提取物 |
常见的浓度 |
MAC-1 |
2.00 |
3.00 |
3.00 |
2.00 |
NH4Cl, 1.00; MgCl•7 h2啊,1.00; KH2阿宝40.40; 氯化钾,0.50; NaHCO3.1.00; l -半胱氨酸盐酸盐一水,0.45 |
MAC-2 |
2.00 |
1.00 |
1.50 |
1.00 |
|
MAC-3 |
0.00 |
1.00 |
1.50 |
1.00 |
|
MAC-4 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
1.00 |
|
MAC-5 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
表1:MAC1-MAC5营养培养基浓度(g/L)。
蒸馏水在121℃下蒸压45分钟,去除溶解氧。营养培养基在500毫升蒸馏水烧瓶中配制。使用磁力搅拌器在60℃的无菌台中搅拌2小时,然后与等体积的煤层水(体积比1:1)在室温下再放置一小时。在整个实验过程中,氮保护被用来在持续的厌氧环境中维持营养。所有营养培养物的最终pH维持在6.0。对照样品100 mlMAC-1、MAC-2、MAC-3、MAC-4、MAC-5分别密封于无菌玻璃瓶中,-40℃保存,灌氩气密封瓶顶空间。
在烧瓶中使用气体替代方法确保无氧条件。用二氧化碳监测系统(由E2V制造)实时监测气体置换过程。每次实验使用50.00±1 g的煤样和500.00 mL的培养基。实验开始时,用氮来密封烧瓶的上部空间。烧瓶置于35ºC的培养摇床中,以80转/分钟的转速搅动,以最大限度地提高煤-液传质速率。每个营养组设计12个平行试验,在相同条件下培养40天。
在无煤样(MAC-1*、MAC-2*、MAC-3*、MAC-4*和MAC-5*)的情况下进行对照实验,以确定外源有机物是否有可能提供额外的碳以提高生物甲烷产量。每个营养组的对照实验使用100 mL的培养基和400 mL的新培养基。在上述条件下培养40天。
阳离子正交分析
谨慎的正交分析是基于生物降解过程中阳离子元素的消耗16(45)正交表,其中包含Na+K+、钙2 +和毫克2 +.离子浓度最低的是MAC-4介质,最高的是东海离子浓度。fm103的量为50.00±1克#每次实验均采用气煤样。烧瓶的上部用氮气密封。烧瓶放置在35ºC的培养摇床上,以80转/分钟的转速搅动,以最大限度地提高煤-液传质速率。正交试验培养40 d。
气体分析
用50 μ l气体注射器采集气体样品。甲烷和二氧化碳分析使用安捷伦7890 A气相色谱仪(由安捷伦制造)。氮气(载气)流速设置为1.00 mL/min。注入口保持在150ºC,烘箱温度设置为25ºC,导热检测器(TCD)设置为200ºC。甲烷的停留时间为3.76分钟,二氧化碳为5.0分钟。校准标准包括40%的甲烷、20%的二氧化碳、10%的氢和30%的氮,在大气压力下注入,生成校准图。
营养代谢分析
营养离子浓度分析使用HC-800电离分析仪(由Histrong Technologies生产)。主要指标包括氟、氯、硝、亚硝酸盐氮、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、氨氮、钠、钾、镁、钙、pH、水硬度和总碱度。
营养物质丰度对煤生物降解的影响
本研究评估了MAC-1、MAC-2、MAC-3、mac -4和mac -5 5种不同的有机复合营养物浓度。在这些培养基中,醋酸钠是一种集体培养基,是产甲烷的碳源,通常为[18]。葡萄糖是产氢乙酰原的媒介。牛肉提取物是多肽和氨基酸、核苷酸组分、有机酸、矿物质和一些维生素的混合物。它经常被用来提供碳和氮的来源。酵母提取物含有氨基酸、多肽、水溶性维生素和碳水化合物的混合物。在文化媒体中也经常使用。有机浓度的排列顺序为MAC-1 > MAC-2 > MAC-3 > MAC-4 > MAC-5。
煤层产甲烷菌群由多种微生物组成。至于产甲烷菌,只有有限数量的简单碳化合物,如CO2或者醋酸盐可以作为底物。为了将复杂的有机化合物转化为甲烷,需要发酵菌和醋酸菌。因此,他们组成了一个相互作用的产甲烷联盟[20]。在气煤生物降解过程中,发酵菌对煤有机物的水解和发酵能力起着重要作用,CO2是生产气体的主要化合物。培养基中的牛肉提取物为细菌提供了额外的碳和氮。在产醋菌发酵过程中,长链脂肪酸和糖降解生成乙酸、CO2和H2[18]。葡萄糖是促进醋酸菌发酵的培养基。产甲烷菌产生CH4与公司2和H2或醋酸。为了提高产甲烷菌[21]的醋酸盐供应,引入了醋酸钠。
如果财团在一个良好的平衡,大部分CO2和H2将用于格式化CH4.CH的浓度4应高;同时,CO2和H2应保持在低位。因此,微生物发酵过程的产气浓度可以反映细菌平衡状况。培养基中充足的有机营养物质可以促进发酵菌和产醋菌的繁殖,提高产甲烷菌营养物质的生成。但是,如果培养基中含有过多的有机营养物质,如牛肉提取物和葡萄糖,发酵菌或醋酸菌的大量繁殖会打破微生物平衡,从而提高二氧化碳的产率,抑制产甲烷。这一现象在MAC-1、MAC-2和MAC-3培养实验中都有体现(图1)。
结果表明,mac -4是提高生物产甲烷速率的最有效介质。以1 g/L的酵母浸膏为最佳浓度,可优化微生物发酵过程中有机氨基酸、多肽和水溶性维生素的含量。MAC-4培养组的最大甲烷浓度达到23.62%(图1),平均是MAC-2、MAC-3、mac -5组的4倍。MAC-4*对照实验和MAC-5组验证了无烟煤对生物甲烷产量提供碳是重要的(图1)。
图1:甲烷和二氧化碳产量的变化是培养基营养和培养时间的函数。
图A为甲烷浓度随培养天数的变化。图B为实验中不提供煤样的对照实验。图C为co2浓度随培养天数的变化。图D为实验中不提供煤样的对照实验。甲烷是确定产甲烷生物活性的主要因素。而二氧化碳是鉴定发酵菌和产醋菌活性的重要因素。只有在一定条件下,发酵菌和产醋菌的活性才会提高甲烷的产率。有机物对发酵菌和产醋菌均有促进作用。但是,如果发酵菌和产醋菌的活性过高,则会抑制产甲烷菌。当甲烷产量和甲烷与二氧化碳的最佳配比达到最高时,微生物群将处于良好的平衡状态。 Thus the MAC-4 medium culture group fit for the requirements.
从MAC-1和MAC-2培养基中获得的高二氧化碳和低甲烷浓度的数据表明,大量有机底物的添加增强了水解细菌,然而,即使添加乙酸钠,甲烷的生物合成也趋于抑制。在MAC-1和MAC-2实验中,醋酸原菌也受到培养基中醋酸钠的影响而受到抑制。
除乙酸钠外,MAC-2培养基浓度相同的MAC-3培养基对产甲烷菌有促进作用,对产甲烷菌有抑制作用。经过40天的培养,平均H2气体分析表明,MAC-3和MAC-3*组的体积浓度分别为67.2%和59.15%。这个量是所有其他实验组的33-40倍。外源有机质在碳供应中起着重要作用。
而有机营养除了提供有机营养外,还发挥着补充维生素等微量元素的作用。没有维生素和微量元素以及有机营养物质的供应,菌落生长速度会变慢,如观察到的MAC-5。
产甲烷菌群的营养代谢分析
分析了初始和最终培养基中MAC-4离子浓度的变化。分析的数据表明,钠、钾、氨氮和镁的浓度被微生物消耗。其中85.78%的钠被微生物发酵利用。在此期间,培养基pH从6.65变化到7.32。相比之下,硫酸盐和碳酸氢盐的浓度增加了1.5-7倍(表2)。这些数据表明,钠、氮、钾和镁是产甲烷联合发酵的关键元素。但是,介质中的硫酸盐应保持在较低的水平。
pH值 |
氟化 |
氯 |
硝态氮 |
亚硝酸盐氮 |
磷酸 |
硫酸 |
碳酸盐岩 |
|
最初的 |
6.65 |
3.70 |
81.58 |
- |
- |
44.67 |
195.80 |
- |
最后 |
7.32 |
5.18 |
95.90 |
- |
- |
38.60 |
478.40 |
- |
碳酸氢 |
钠 |
氨氮 |
钾 |
镁 |
钙 |
水的硬度 |
总Aalkalinity |
|
最初的 |
40.66 |
811.90 |
193.60 |
159.00 |
38.89 |
21.06 |
212.56 |
40.66 |
最后 |
328.77 |
115.40 |
39.23 |
35.30 |
14.30 |
22.76 |
115.62 |
328.77 |
表2:MAC-4培养基离子浓度随产甲烷菌群生物降解而变化。
注意事项正交分析
从营养元素浓度的分析可以看出,钠、氨、氮、钾、镁在产甲烷微生物代谢中起着重要作用。采用正交分析实验研究阳离子对生物甲烷产量的影响。正交模组引入4个阳离子(Na+K+、钙2 +、镁2 +)进行了4种不同浓度的测试。其中,MAC-4离子浓度最低,东海离子浓度最高。L16(45)正交表作为正交分析模块(表3)。
序列号 |
因素(更易/ L) |
结果 |
|||||
Na |
毫克 |
Ca |
K |
CH4 |
有限公司2 |
||
1 |
23 |
1.3 |
0.5 |
10.7 |
6.65 |
4.71 |
|
2 |
23 |
6.7 |
1.7 |
1.7 |
3.92 |
4.27 |
|
3. |
23 |
13.0 |
3.4 |
3.4 |
0.92 |
4.03 |
|
4 |
23 |
20.0 |
5.1 |
5.1 |
0.46 |
3.23 |
|
5 |
130 |
1.3 |
1.7 |
3.4 |
6.59 |
4.84 |
|
6 |
130 |
6.7 |
0.5 |
5.1 |
3.85 |
3.56 |
|
7 |
130 |
13.0 |
5.1 |
10.7 |
0.99 |
3.31 |
|
8 |
130 |
20.0 |
3.4 |
1.7 |
0.38 |
2.94 |
|
9 |
260 |
1.3 |
3.4 |
5.1 |
6.49 |
4.47 |
|
10 |
260 |
6.7 |
5.1 |
3.4 |
3.76 |
4.73 |
|
11 |
260 |
13.0 |
0.5 |
1.7 |
0.57 |
2.47 |
|
12 |
260 |
20.0 |
1.7 |
10.7 |
0.34 |
2.84 |
|
13 |
390 |
1.3 |
5.1 |
1.7 |
7.01 |
4.86 |
|
14 |
390 |
6.7 |
3.4 |
10.7 |
0.30 |
3.90 |
|
15 |
390 |
13.0 |
1.7 |
5.1 |
0.47 |
2.28 |
|
16 |
390 |
20.0 |
0.5 |
3.4 |
0.30 |
2.67 |
|
CH4 |
k1 j |
2.99 |
6.69 |
2.84 |
2.97 |
||
k2 j |
2.95 |
2.96 |
2.83 |
2.89 |
|||
k3 j |
2.79 |
0.74 |
2.02 |
2.82 |
|||
k4 j |
2.02 |
0.37 |
3.06 |
2.07 |
|||
Rj |
0.97 |
6.32 |
1.03 |
0.90 |
|||
有限公司2 |
k1 j |
4.06 |
4.72 |
3.35 |
3.64 |
||
k2 j |
3.66 |
4.12 |
3.56 |
4.07 |
|||
k3 j |
3.63 |
3.02 |
3.84 |
3.39 |
|||
k4 j |
3.43 |
2.92 |
4.03 |
3.69 |
|||
Rj |
0.63 |
1.80 |
0.68 |
0.68 |
表3:CH的注意正交分析表4和有限公司2.结果表示两种气体的体积百分比单位。下表为CH4和有限公司2范围。
采用极差分析法确定各因素之间的影响顺序。R范围j用模块1计算。
在哪里kjm是m级j因子(模块2)的平均结果,(j, m = 1,2,3,4)。
在哪里yjmi是m级j因子数I数据的结果,(j, m, I = 1,2,3,4)。
极差分析证实,对于产甲烷活性,最佳离子浓度增强CH4收益率是Na1、镁1、钙4和K1元素有效性由高到低依次为Mg > Ca > Na > k2一代是Na4、镁4、钙1和K3.,其序为Mg > Ca = K > Na。
关于CH的影响存在显著差异4和有限公司2产率与阳离子浓度的函数关系。CH的4生物合成对元素含量更为敏感。最大毫克2 +促进甲烷菌代谢过程的最大阳离子浓度为1.3mmol/L2 +K+, Na+分别为5.1、1.7和23 mmol/L。
采用方差分析对该系统的因子显著性(F)进行分析。F用模3计算。
x我是每个因素和水平的实验结果。
因素 |
广场的异常 |
自由度 |
F值 |
重要的 |
|
CH4 |
Na+ |
2.465 |
3. |
0.892 |
|
毫克2 + |
100.905 |
3. |
36.533 |
* |
|
Ca2 + |
2.486 |
3. |
0.900 |
||
K+ |
2.080 |
3. |
0.753 |
||
错误 |
2.762 |
3. |
|||
有限公司2 |
Na+ |
0.842 |
3. |
8.592 |
|
毫克2 + |
9.120 |
3. |
93.061 |
** |
|
Ca2 + |
1.079 |
3. |
11.010 |
* |
|
K+ |
0.954 |
3. |
9.735 |
||
错误 |
0.098 |
3. |
表4:4个因素与CH的方差分析表4和有限公司2数据。
根据F的计算,Mg2 +是CH的显著警告因素吗4和有限公司2(表4)这种离子对抑制CH特别敏感4代谢过程主要为气-煤产甲烷联合体。
煤中某些有机化合物的微生物生物降解是目前可用于提高煤层气质量的一种技术。微生物通过厌氧消化过程的协同作用,实现了采矿中次生生物成因甲烷的生成和储层强化。根据本报告的实验,得出以下结论:(1)有机营养物质的剂量应根据产甲烷菌群的需要进行调整。过量或不足的有机养分支持剂量会对生物群落的烷产量产生不利影响;(2) MAC-4是促进抚顺气煤层厌氧消化的最有效介质;(3)钠、氮、钾、镁是产甲烷联合发酵的关键元素;(4)影响抚顺产甲烷菌群代谢的警戒等级依次为Mg > Ca > Na > K,最大警戒浓度为Mg2 +、钙2 +K+, Na+分别为1.3、5.1、1.7和23 mmol/L;(5)毫克2 +是一种特别敏感的因子,可以抑制产甲烷菌。
气煤产甲烷联合培养的养分浓度
煤的生物群落烷生成涉及到环境因素和生物群落之间复杂的相互作用。生物群落由水解发酵菌、同营养乙酰原菌、产甲烷菌和许多其他细菌组成。环境不仅包括物理因素,还包括煤、煤层气水;煤层气和其他我们称之为环境的复杂地层。
注入煤层的介质富集了煤层的营养物质。本报告的一系列实验证实,营养培养基需要严格的浓度控制才能有效,特别是那些涉及有机材料的培养基。如果有机化合物过于丰富,就像我们用MAC-1、MAC-2和MAC-3的配方模拟的那样,过多的营养水平将对微生物群落结构产生不利影响。水解发酵菌和产乙酰菌的快速生长可以抑制甲烷的生物合成。相比之下,如果缺乏有机营养,如MAC-5模型,促进甲烷生物合成的潜力较低,产量增长缓慢。所需要的营养浓度应根据不同的功能而不同:(1)甲烷生物合成类型,如二氧化碳减少或醋酸盐发酵;(2)煤的成熟度等级,如煤气煤、火焰煤、烟煤或褐煤。需要确定不同煤种所需的确切有机营养,以最大限度地提高生物甲烷产量。
离子浓度提高生物甲烷产量
有机生物降解甲烷是一个微生物协同作用的过程。发酵菌最初水解复杂的有机化合物为醋酸酯,长链脂肪酸,二氧化碳,氢,nhh4+和海关-.同养产氢(质子还原)乙酰生菌将中间代谢物还原为醋酸盐、二氧化碳和氢。利用氢的乙酰生菌对低分子量木质化合物进行脱甲氧基化,并发酵一些羟基芳香族化合物。产甲烷细菌依赖于其他细菌产生的氢,将二氧化碳或碳酸氢盐还原为甲烷。醋酸盐发酵产甲烷菌通过醋酸盐生物降解产生甲烷。
群落中不同的微生物活动需要不同的营养物质。正交试验结果表明,谨慎浓度对微生物的代谢过程有重要影响。除注意正交分析中分析的钠、钾、镁、钙外,氮、酵母浸出物、盐度和pH值都有可能影响生物甲烷的合成。需要进一步研究离子对煤层生物群落的影响,以揭示气煤层微生物的活性。
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
作者感谢以下几家公司为本文提供的煤样和其他信息所做的贡献:老虎台矿业。
基金资助:中国矿业大学煤炭资源与安全开采国家重点实验室自主研究项目(批准号:SKLCRSM19X0012: DX)、煤炭资源与安全开采国家重点实验室开放研究项目(批准号:SKLCRSM17KFA08: DX)、山西省重点研发计划重点基础项目(批准号:201703D211003: YZ)。
引用:肖东,侯勇,王娥,张勇(2020)有机基质和阳离子对无烟煤产甲烷联合生物产甲烷的影响。Adv Microb Res 4: 011。
版权:©2020董晓等。这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布,该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是注明原作者和来源。