膜透析是蛋白质纯化中分离小分子物质的一种简单而广泛应用的生化技术。在从当地提取工业上有用的酸性蛋白酶的过程中曲霉属真菌种，在蛋白质纯化的第一步用硫酸铵作为盐析剂。在对硫酸铵沉淀蛋白酶富集样品进行透析时，我们反复发现透析管有不规则穿孔。对蛋白酶来源的仔细分析表明，纤维素酶存在于富含蛋白酶的样品中曲霉属真菌物种负责在膜中形成孔的行为。在bigel - p100(聚丙烯酰胺珠)上进行简单的凝胶过滤，可以有效分离蛋白酶和纤维素酶中的硫酸铵，从而避免透析。这些研究提供了透析技术的一个局限性，并建议在处理含有纤维素酶的样品时不要使用纤维素基透析管。
蛋白质纯化对于理解任何蛋白质的结构和功能都是至关重要的。蛋白质纯化的方法一般涉及多个色谱分离步骤[1]。当从天然来源提纯蛋白质时，浓缩我们感兴趣的酶是首要的必要条件。常用的浓缩方法包括超滤[2]、蔗糖[3]反透析、冷冻溶剂(4°C至-20°C)沉淀[4,5]和二价阳离子盐[6]盐析。其中，常用的是蛋白质沉淀的盐析法。最常用的盐种是硫酸铵[7]。然而，去除硫酸铵对蛋白质的后续纯化是必要的，因为它会干扰许多进一步的纯化步骤和蛋白质定量[8,9]。然而，这些传统的蛋白质分离方法是相当耗时和涉及多个步骤。最近，水相两相浮选(ATPF)或液体双相浮选(LBF)技术也被开发出来，并在多个实例中成功实现[10,11]。
来自低等生物的蛋白酶有巨大的工业应用，研究人员正在寻找具有高催化转化率和高稳定性的蛋白酶的更新来源。在寻找一种工业上有用的酸性蛋白酶的过程中，我们发现了一株黑曲霉产生耐热酸性蛋白酶。我们最初用硫酸铵盐析法富集这种酶。用50%的硫酸铵盐渍蛋白酶。为了去除下一步的硫酸铵，我们使用分子量切断10KDa的透析管。我们发现透析管在膜上经历了多个不规则穿孔，导致样品丢失。我们最初怀疑是透析管制造商的缺陷，但事实并非如此。经过仔细分析，我们发现穿孔是由于协同洗脱纤维素酶作用于透析管。然后，我们成功地使用生物凝胶- p100(由聚丙烯酰胺珠制成的凝胶过滤基质)去除硫酸铵。我们相信，这些发现为处理真菌酶的学生和研究人员提供了预防信息。
材料
黑曲霉培养液来自Kaypeeyes生物技术有限公司，位于印度卡纳塔克邦迈苏鲁的赫巴尔工业区。羧甲基纤维素(cm -纤维素)(钠盐)和透析管(纤维素膜)来自美国密苏里州圣路易斯的SigmaAldrich;血红蛋白来自美国加州圣安娜的MP生物医药公司;生物凝胶- p -100来自美国加州赫尔克里斯的Biorad;旋转柱从英国Little Chalfont的GE医疗保健公司采购;三氯乙酸(TCA)、二硝基水杨酸(DNS)和内斯勒试剂来自印度马哈拉施特拉邦孟买的Lobachemie。
方法
酸性蛋白酶的生产A.niger：
答:尼日尔以麦麸为底物，采用固态发酵培养。在100克麦麸中，加入0.2 N含微量矿物质的盐酸60毫升(CuSO各70毫克)4, ZnSO4和FeSO4每100 mL 0.2NHCl)。无菌麦麸接种答:尼日尔孢子悬液，30°C孵育7天。发酵物中胞外酸性蛋白酶在0.1 M NaCl中提取，4℃7000 g离心10 min回收，用Whatman滤纸过滤。1.清上清液作为酶源。
酸性蛋白酶测定:酸性蛋白酶的测定方法与[4]描述的一致，但有轻微的修改。简单地说，以pH为4.0的0.1 M醋酸缓冲液中制备的2%(酸变性)血红蛋白为底物。加入0.4 mL(0.5-5µg)酶，60℃孵育10 min，加入2 mL 5% TCA抑制反应，室温孵育20 min。20 min后，用Whatman滤纸过滤反应混合物。1，含释放酪氨酸的上清液在280 nm处吸光度测定。使用酪氨酸标准(0-60µg/mL)计算酪氨酸释放量。在标准测定条件下，一个蛋白酶活性单位被定义为每分钟释放1µg酪氨酸所需的酶量。
纤维素酶的测定:纤维素酶测定方法按照Wood和Bhat[12]所描述的方法进行，并进行了轻微修改。简单地说，0.1 mL(50-150µg)酶添加到0.1 M醋酸缓冲液pH 5.0制备的0.9 mL 1% cm -纤维素中。酶反应在40°C下进行120 min，加入1 mL DNS试剂终止反应。管子在沸水浴中煮沸10分钟，冷却后加入8毫升蒸馏水。在540 nm处读取吸光度，用葡萄糖标准(0-1000µg/mL)计算葡萄糖释放量。在标准测定条件下，纤维素酶活性的一个单位被定义为每分钟释放1摩尔还原糖(以葡萄糖表示)的酶的数量。
硫酸铵分馏酸性蛋白酶:在培养上清液中，分别加入硫酸铵至30%饱和度，然后分别加入50%和60%，在4℃下持续搅拌6 h。沉淀在4℃下7000 g离心30分钟收集(在一些实验中，每次分离的样品都保留在一边，用于蛋白酶和纤维素酶的测定)。
透析:将比活性最高的50%硫酸铵颗粒重新悬浮在pH为5.0、NaCl为0.1 M的50 mM醋酸盐缓冲液中，与相同的缓冲液进行透析。
Biogel-P100色谱法:在pH值为50 mM的醋酸盐缓冲液(含0.1 M NaCl)中重悬蛋白酶比活性最高的50%硫酸铵球团。样品(2ml含100mg蛋白质)装在1.5cm × 78cm的柱上，柱中填充137ml Biogel P100聚丙烯酰胺小球，用50 mM醋酸盐缓冲液pH 5.0平衡，含0.1 M NaCl，用相同的缓冲液洗脱。以20ml/h的流速收集馏分，在280nm处监测吸光度。对每个组分的蛋白酶、纤维素酶和氨的存在进行了评估(见下文)。
蛋白质的评估:蛋白质估计进行描述[13]和Biuret的方法[14]。A)洛瑞法:这种方法涉及两种反应，导致颜色复合物的形成。在第一次反应中，铜[II]在碱性条件下与蛋白质中的肽键反应，导致它们还原为铜[I]离子。随后的反应涉及到磷钼双磷钨酸通过铜催化的芳香酸氧化还原为杂多钼蓝。形成的蓝色络合物在660 nm处测量。以BSA为标准构建标准图(15- 75µg/mL)计算样品中蛋白质的浓度。B)双缩脲法:在碱性条件下铜[II]离子与肽键反应，形成淡紫色配位配合物，在540 nm处测定。用牛血清白蛋白(1-5 mg/mL)构建的标准图计算蛋白质含量。
氨的量化:氨定量使用内斯勒试剂[15]。生物凝胶P-100的每个组分用内斯勒试剂处理，并在425 nm处读取吸光度。用氨水制备的标准液(1-20µg/ml)计算氨含量。
透析是一种简单的技术，但对含有纤维素酶的样品没有用处。
全球工业酶销售额超过30亿美元，其中蛋白酶占60%以上。这些蛋白酶有广泛的应用，大多来自微生物来源[17]。在微生物中，酶类来源于丝状真菌等曲霉属真菌由于生产成本低，易于下游加工，加上真菌生长更快和酶[18]的分泌特性，物种比其他微生物来源有许多优势。筛选一种工业上有用的蛋白酶曲霉属真菌物种，我们发现了一种酸性蛋白酶黑曲霉它具有高催化转化率和热稳定性等工业上可取的品质。因此，我们决定用传统的蛋白质纯化技术来纯化这种真菌蛋白酶。硫酸铵沉淀蛋白(盐析法)是广泛应用于蛋白质纯化的一种常规而简单的技术。然而，后续去除残留的硫酸铵对于进一步纯化酶是非常必要的。为了从样品中分离硫酸铵，使用硝化纤维素膜进行透析。但是，每次在透析过程中，由于膜上的气孔形成，样品都会丢失(图1)。虽然我们最初怀疑是生产厂家的缺陷，但后来我们发现了一种酶的罪魁祸首。这个罪魁祸首就是纤维素酶。因此，我们发现在蛋白酶阳性的所有馏分中都有可检测到的纤维素酶活性(表1)。为了分离硫酸铵，我们使用了自旋柱(由聚醚砜制成)，但这导致酶的回收率低。因此，我们继续进行差分硫酸铵分馏，试图将纤维素酶从蛋白酶中分离出来。然而，在不同硫酸铵分选的所有步骤中，纤维素酶的活性也随着蛋白酶的活性而增强(表1)。因此，我们决定使用其他色谱分离步骤，这些步骤需要事先去除硫酸铵。 Among the available methods, simple dialysis was the method of choice. However, we came across the problem of cellulase action on dialysis tubing. Therefore, dialysis is not always the best technique for the removal of small molecules. Cellulases degrading cellulose is not new [19], but while purifying proteases co-purifying cellulases degrading cellulose was new to us. Similar difficulty was also encountered recently by Monico et al., where dialysis was not efficient in removing EDTA [20]. Other option for us at this stage was to use non-cellulosic dialysis membrane, but then they are expensive and often available in broad cut off range and not available with all the vendors. Hence, we decided to use biogel-P100.
图1:透析管穿孔:粗真菌提取物用固体硫酸铵沉淀(见方法)。广泛的透析过程中，由于纤维素酶的作用，透析管内形成了气孔。注意透析管在向下挤压时样品的丢失。
bigel - p -100能有效去除硫酸铵
一旦我们意识到纤维素酶与我们感兴趣的蛋白酶协同纯化，使用纤维素基膜进行透析将是徒劳的练习。因此，我们尝试用分子筛法去除硫酸铵。50%硫酸铵颗粒显示出显著的蛋白酶和纤维素酶活性(表1)。该组分被加载到生物凝胶P100柱上。负载的蛋白质在第一个峰被洗脱(分数为20-42)(图2A和2B)，而硫酸铵(分数为52-69)随后被洗脱(图2C和2D)。我们用内斯勒试剂和测量电导证实了硫酸铵的洗脱。含有蛋白质的馏分(馏分20-42)对奈斯勒试剂无反应性，而含有硫酸铵的馏分(馏分52-69)对奈斯勒试剂有反应，并显示电导(图2C和2D)。
图2:使用生物凝胶p100进行分子筛分。2 ml含100 mg蛋白质的50%硫酸铵颗粒，用生物凝胶- p100进行分子筛分，之前用50 mM pH 5.0醋酸盐缓冲液(含0.1 M NaCl)平衡，并在280nm处监测各组分的吸收情况。用奈斯勒试剂测定每个组分的A)蛋白酶活性B)纤维素酶活性C)电导率D)氨。注意蛋白酶(分数23-33,A)和纤维素酶(分数20-42,B)的共洗脱。硫酸铵从分数52-69洗脱，这是由电导和对内斯勒试剂的阳性反应证实的。数据代表了3个以上独立实验的典型洗脱剖面。注意在280nm处的吸光度(-)对应于蛋白质(分数20-42)和无特征的有色物质(分数≈44-80)。
样本 |
体积毫升 |
蛋白质毫克/毫升 |
蛋白酶 |
纤维素酶 |
|
|
活动U /毫升 |
特定的活动U /毫克 |
活动U /毫升 |
特定的活动U /毫克 |
|
|
粗提物 |
47 |
15.4 |
3835.8 |
249 |
2.64 |
0.171 |
|
硫酸铵30%上清 |
50 |
13 |
4319.9 |
332.2 |
1.49 |
0.114 |
|
硫酸铵30%颗粒 |
4 |
50 |
4748.5 |
94.96 |
11.35 |
0.227 |
|
硫酸铵50%上清 |
49 |
8 |
95.2 |
11.9 |
- |
- |
|
硫酸铵50%颗粒 |
4 |
53.8 |
37281.1 |
703.4 |
16.9 |
0.314 |
|
硫酸铵60%上清 |
46.5 |
6 |
12.87 |
6.4 |
- |
- |
|
硫酸铵60%颗粒 |
0.8 |
16 |
5003.7 |
312.6 |
0.78 |
0.048 |
|
表1:硫酸铵分馏蛋白酶。在培养上清中加入计算量的硫酸铵，达到30-60%的饱和度。蛋白酶和纤维素酶活性测定方法所述。蛋白酶和纤维素酶在每个饱和阶段都有共沉淀，50%的颗粒比活最高。
虽然透析硫酸铵在蛋白质纯化中被广泛使用，但对含有纤维素酶的样品不建议特别使用。使用生物凝胶- p100分子筛分而不是透析有效地从样品的其余部分去除硫酸铵。众所周知，几乎所有的真菌都含有纤维素酶和其他酶，常用的透析膜很可能被真菌制剂中存在的纤维素酶降解。因此，我们强烈建议在使用真菌酶时不要使用纤维素基透析管。
作者非常感谢经济支持和曲霉属真菌Kaypeeyes生物科技有限公司的文化。印度迈索尔。GKM感谢卓越学院、迈索尔大学、教资会主要研究项目、科学与技术愿景小组(VGST)、卡纳塔克邦政府和教资会特别援助计划(UGC-SAP)。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决定或稿件准备方面没有任何作用。此手稿的作者声明没有利益冲突。
