PI3K抑制下肺纤维化患者肺灌洗细胞的转录组学调控

全肺灌洗(WLL)

被诊断为肺纤维化(尘肺病)的患者在认证的临床机构接受WLL作为推荐的医疗治疗。术中加热0.9%生理盐水至37℃，单侧纯氧通气后20分钟进行肺灌洗，引流液由浑浊变为全透明时终止。受患者肺容量和尘肺病分期的影响，常规作为医疗废物丢弃的肺灌洗液总量一般为4000-6000毫升。患者被告知了拟议的研究，并允许将其肺灌洗液用于生物医学研究目的。因此，在WLL后，收集到无菌容器中的肺灌洗液没有被丢弃，而是立即转移到实验室进行进一步的生物医学实验。该研究设计由该机构的研究伦理委员会审查和批准。

从肺灌洗液中分离细胞

用双层纱布过滤肺灌洗液，去除粘液等块状物，倒入50ml管中，以1800转/分离心5分钟。丢弃上清，PBS洗涤2-3次。球团聚集后重悬于DMEM培养基(Gibco)中，培养基中添加10%胎牛血清(FBS, Gibco)和1X青霉素-链霉素混合物(HyClone)。细胞在光镜下成像以评估质量，测量密度并在25厘米内培养²塑料烧瓶(康宁)在培养箱(5% CO₂, 37°C)。在低温保存中，细胞被重新悬浮在添加10%二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)的培养基中，并在-80°C的冰箱中冷冻。

抑制处理和设计

细胞在37°C的5%湿润CO中培养₂并分为对照组和渥曼肽抑制PI3K治疗组。对照组细胞在培养基中培养，实验组细胞在添加10 nM渥曼肽的培养基中培养6h。对照组和试验组均为独立重复。

RNA-seq实验与生物信息学分析

从细胞中提取总RNA，用聚t寡聚磁性珠从总RNA中纯化mRNA。在高温下使用二价阳离子进行mRNA的片段化，然后使用随机六聚体引物合成cDNA。将3 '端DNA片段进行腺苷化处理后，结扎具有发夹环结构的适配器，准备进行杂交。用AMPure XP系统(Beckman Coulter)对文库片段进行纯化，筛选出长度约为400 bp的cDNA片段。PCR反应后，纯化产物，并在生物分析仪2100系统(安捷伦)上评估文库质量。文库制备物最终在Novaseq平台(Illumina)上测序，序列生成150 bp对端reads。所有RNA-seq实验都在独立的三重复中重复。

对FASTQ格式的原始reads进行预处理，使用Hisat2与参考基因组(GRCh38)对齐，并转换为BAM文件，用于r中后续的RNA-seq分析[19,20]，根据DESeq2分析管道和绝对日志阈值进行差异表达₂差异表达基因(DEGs)的鉴定采用大于1的(倍数变化)和小于0.05的调整P值。

蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

互作基因检索工具(STRING)数据库(http://string-db.org/)[21]是一个旨在探索和分析PPI信息的在线工具。为了评价抑制实验后DEGs之间的相互作用，使用STRING对DEGs进行映射，选择组合得分为> 0.7的相互作用。将网络中连接最紧密的前10个基因定义为枢纽基因，以识别生物过程(Biological Processes, BP)中的关键元素。

Oncomine数据库中基因表达的验证

Oncomine (www.oncomine.org;离子激流;Thermo Fisher Scientific, Inc.)是一个在线癌症微阵列数据库，可促进全基因组表达分析，在该数据库中，我们对鳞肺癌(SQCLC)中的PI3K抑制进行了分析。检索Oncomine数据库中[23]和Bhattacharjee等人[24]肺癌基因表达数据，获取带有Pvalue的PI3K通路表达水平

在R统计软件中进行数据分析和可视化。对于单一零假设检验，使用0.05的显著性水平。对于需要控制错误发现率(FDR)的多次试验，用Benjamini-Hochberg (BH)方法调整原始P值，以获得调整后的P值。

尘肺病的主要病理特征是慢性肺部炎症和进行性肺纤维化。肺纤维化患者肺微环境免疫反应的激活与PI3K通路的诱导有关，但尘肺病诱导肺纤维化的分子机制尚未完全阐明。在肺纤维化患者肺微环境免疫应答的激活下，肺灌洗细胞(主要是肺泡巨噬细胞等)维持了其固有的转录谱。wortmannin抑制PI3K通路后，预期会出现一系列转录变化，但未知。利用RNA-seq作为下一代高通量测序技术，这种基因表达变化可以通过差异表达基因(DEGs)的谱图来揭示。对于对照处理vs。实验处理，制备3个重复，平行进行试验。参数阈值设置为log2倍的绝对变化大于1，调整后的p值小于0.05以控制错误发现率(error Discovery Rate, FDR)，火山图揭示了渥曼宁抑制PI3K后患者源性肺灌洗细胞的转录变化(图1)。相比之下，在PI3K抑制的情况下，共鉴定出3356个差异表达基因(1990个上调基因，1366个下调基因)。MA图显示，deg主要是高表达基因，因此观察到的差异表达很难归因于低表达水平的错误发现(图2)。

图1:抑制PI3K靶点后获得的DEGs的火山图。共鉴定差异表达基因3356个(上调基因1990个，下调基因1366个)。对抑制前后上调和下调的基因进行注释。采用绝对值log2(倍数变化)为1的阈值和调整后的P值为0.05的阈值来识别差异基因。

图2:抑制PI3K靶点后DEGs的MA图。deg主要是高表达基因，因此观察到的差异表达很难归因于低表达水平的错误发现。

抑制PI3K后，229个被识别出的DEGs (log2 Fold Change > 3，Padj < 0.0001)被包含在STRING在线数据库的分析中。共筛选44个基因进入PPI网络复合物，包括217个节点和132个边，其中185个基因位于DEGs PPI网络外(图3)。随后筛选出10个在网络中连性最高的枢纽基因，分别为血管生成素Like 4 (ANGPTL4)、锚蛋白重复结构域1 (ANKRD1)、atp酶H+转运V1亚基G2 (ATP6V1G2)、钙调素调控Spectrin相关蛋白家族成员3 (CAMSAP3)、线圈结构域包含蛋白151 (CCDC151)、C-C基序趋化因子配体1 (CCL1)、C-C基序趋化因子配体15 (CCL15)、C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)、C-C基序趋化因子配体8 (CCL8)和染色质许可和DNA复制因子1 (CDT1)(图4)。顶部轮毂基因的上调或下调分布均匀，因此重点的转录组变化是双向的。这10个枢纽基因在三个重复实验样本中的聚类热图显示了显著的复制和协调关联(图5)。DEGs的发现，特别是顶部枢纽基因及其相关通路的发现，确定了肺灌洗细胞内PI3K抑制所干扰的生理和生化过程，提示了功能靶向的潜在基因组。

图3:由deg和hub基因构建的PPI网络。使用STRING在线数据库，总共有44个DEGs被过滤到DEGs PPI网络综合体中。节点代表蛋白质，边缘代表蛋白质之间的相互作用。

图4:前10个轮毂基因的表达水平。5个上调的轮毂基因是C-C基序趋化因子配体1 (CCL1)、C-C基序趋化因子配体15 (CCL15)、C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)、C-C基序趋化因子配体8 (CCL8)和锚定蛋白重复结构域1 (ANKRD1);5个下调的枢纽基因是血管生成素样4 (ANGPTL4)、atp酶H+转运V1亚基G2 (ATP6V1G2)、钙调蛋白调控的光谱相关蛋白家族成员3 (CAMSAP3)、含有蛋白151的螺旋结构域(CCDC151)和染色质许可和DNA复制因子1 (CDT1)。

图5:前10个轮毂基因的表达热图。热图显示对照组和pi3k抑制组之间差异表达的10个hub基因的表达谱。

在Oncomine数据库中分析PI3K通路的靶基因，以探索该信号通路与鳞细胞肺癌(SQCLC)之间的关系，SQCLC是一种至少与肺纤维化部分相关的癌症类型。SQCLC样本中PI3K及其下游效应因子AKT、mTOR等mRNA表达水平与正常肺样本有显著差异(图6)，提示PI3K及其下游通路在该类患者肺纤维化中起关键作用。

图6 Oncomine数据库中PI3K/Akt/mTOR信号通路表达分析基因表达数据来自Weiss, Talbot和Bhattacharjee肺数据集，并使用Oncomine进行分析。比较正常肺与SQCLC肺PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平。日志转换的表达水平显示为框图。

为了预测所鉴定的DEGs对肺灌洗细胞PI3K抑制的功能相关性，我们构建了PPI网络进行抑制比较，并选择连接度最高的10个hub基因进行进一步分析，包括ANGPTL4、ANKRD1、ATP6V1G2、CAMSAP3、CCDC151、CCL1、CCL15、CCL2、CCL8和CDT1，主要与免疫系统过程、单核细胞趋化、白细胞迁移调节功能相关等。单个基因的功能是理解其具体作用的关键。例如，ANGPTL4编码的蛋白调节慢性炎症、血管生成和血管通透性[25]，其中炎症在尘肺病发展为肺纤维化[6]中起关键作用。此前的体外研究表明，肺上皮细胞中mTOR (pi3k相关激酶家族中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)的激活可促进肺纤维化和ANGPTL4[26]的表达。此外，4个上调的轮毂基因(CCL1、CCL15、CCL2和CCL8)与趋化因子相关。C-C基序趋化因子配体1 (CCL1)和C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)是聚集在第17号染色体q臂上的细胞因子基因，导致参与免疫调节和炎症的趋化因子的产生。这类细胞因子对单核细胞和嗜碱性粒细胞有趋化活性，但对中性粒细胞和嗜酸性粒细胞几乎没有趋化活性。动物实验进一步证实，CCL2在急性和慢性矽肺模型中表达上调[27,28]。

在下调的hub基因中，钙调素调节的spectrin相关蛋白家族成员3 (CAMSAP3)是维持微管组织和细胞形态发生[29]所必需的。CAMSAP3在人肺癌源性细胞系中缺失，导致Akt蛋白(也称为蛋白激酶B蛋白，PI3K的下游分子)活性[29]上调。PI3K的高诱导激活可导致多种癌症特征，该通路是新的抗癌治疗的一个有吸引力的靶点。一项研究发现，在大量的纤维性矽肺中，非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)的一种类型SQCLC的发生率较高。PI3K及其下游效应子的突变常发生在NSCLC患者[31]中。尘肺病致肺鳞状细胞癌发生发展的分子机制尚未完全阐明，而我们的研究提示CAMSAP3可能参与了这一过程。同样，我们使用Oncomine数据库证明了PI3K通路在SQCLC中存在差异表达vs。正常的肺组织。因此，抑制AMs的PI3K通路不仅可能影响肺纤维化，还可能影响肺纤维化引起的SQCLC。

抑制尘肺患者肺灌洗细胞PI3K通路可引起细胞功能和生理状况的改变通过转录的改变，特别是与免疫系统过程、单核细胞趋化性和白细胞迁移调节相关的基因表达的改变，因此指出了一个潜在的关键靶点，可以减缓甚至暂停尘肺患者的肺纤维化过程。

作者声明不存在利益冲突。

本研究得到国家自然科学基金项目(81800071)和四川省科技厅项目(2019YJ0035)的资助。

1. 王晓燕，王晓燕，王晓燕(2010)吸入性肺疾病。国际占领环境医学1:11 -20．
2. Cullinan P, Reid P(2013)尘肺病。初级护理呼吸杂志22:249-252。
3. 罗燕，齐晓明，庞建林，王杰，王超(2021)尘肺病的组学研究进展。生物与环境科学34:71-82。
4. 合作者(2018)1990-2017年，195个国家和地区354种疾病和伤害的全球、区域和国家发病率、患病率和残疾寿命:2017年全球疾病负担研究的系统分析。《柳叶刀》392:1789 - 1858。
5. 齐晓明，罗燕，宋爱梅，刘燕，舒涛，等(2021)尘肺病研究现状与展望。中医J-Peking 134: 898-907。
6. 邓长武，张晓霞，林建华，黄丽芳，曲丽丽，等。(2017)转化生长因子-beta1遗传变异与尘肺病易感性的meta分析。中华医学杂志(英文版)130:357-364。
7. 病区PA, Hunninghake GW(1998)肺炎症和纤维化。美国呼吸危重症护理杂志157:123-129。
8. Keogh BA, Crystal RG(1982)肺泡炎:间质性肺疾病的关键。胸腔37:1 - 10。
9. Borm PJ, Schins RP(2001)煤矿工人尘肺病易感性的基因型和表型。细胞因子的使用。欧洲呼吸病学杂志32:127-133。
10. Yucesoy B, Luster MI(2007)尘肺病的遗传易感性。毒理学杂志168:249-254。
11. 石绵肺和矽肺的发病机制。美国呼吸危重症护理杂志157:1666-1680。
12. Fujimura N(2000)尘肺病的病理和病理生理学。普尔姆医学评论6:140-141。
13. Kok K, Geering B, Vanhaesebroeck B(2009)健康和疾病中磷酸肌醇3激酶表达的调控。生物化学进展34:115-127。
14. Gwinn MR, Vallyathan V(2006)呼吸爆发:在肺泡巨噬细胞信号转导中的作用。J毒理学环境卫生B危评Rev 1: 27-39。
15. 顾伟，宋杰，曹勇，孙强，姚宏，等(2013)ITS2区域在蕨类植物中卷柏科药用植物条形码中的应用。公共科学图书馆8:67818。
16. 李娜，陈晓伟，霍婷婷，董丰强，邓俊杰(2020)纳米二氧化硅通过PI3K/AKt信号通路影响肺泡巨噬细胞凋亡。四川大学学报，外语版51:488-493。
17. 李宁，石峰，王旭，杨萍，孙凯，等(2021)二氧化硅粉尘暴露通过自噬信号通路诱导肺纤维化。环境毒理学36:1269-1277。
18. 刘红，方松，王伟，程颖，晁杰(2016)巨噬细胞源性MCPIP1通过自噬介导矽肺纤维化。颗粒和纤维毒理学13:55。
19. Love MI, Huber W, Anders S(2014)用DESeq2调节RNA-seq数据的折叠变化和色散估计。基因组生物学15:550。
20. 吴涛，胡娥，徐松，陈敏，郭鹏等(2021)聚类分析器4.0:一种用于解释组学数据的通用丰富工具。创新2:100141。
21. Szklarczyk D, Gable AL, Nastou KC, Lyon D, Kirsch R等人(2021)2021年的STRING数据库:可定制的蛋白质-蛋白质网络，以及用户上传的基因/测量集的功能表征。核酸Res 8: 605-612。
22. Weiss J, Sos ML, Seidel D, Peifer M, Zander T，等(2010)鳞状细胞肺癌中FGFR1的频繁和局灶性扩增与治疗可治疗的FGFR1依赖性相关。中华科学杂志15:62-93。
23. Talbot SG, Estilo C, Maghami E, Sarkaria IS, Pham DK，等(2005)基因表达谱可以区分肺中的原发性和转移性鳞状细胞癌。巨蟹座版65:3063-3071。
24. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J, Li C, Monti S等(2001)通过mRNA表达谱对人肺癌的分类揭示了不同的腺癌亚类。美国科学院学报98:13790-13795。
25. 费尔南德斯-埃尔南多C，苏亚雷斯Y (2020) ANGPTL4:一种参与代谢和血管稳态的多功能蛋白。血液血液学评论27:206-213。
26. Saito M, Mitani A, Ishimori T, Miyashita N, Isago H，等(2020)肺上皮细胞中活性mTOR促进上皮-间质转变并增强肺纤维化。中华呼吸细胞生物学杂志62:699-708。
27. Langley RJ, Mishra NC, Pena-Philippides JC, Rice BJ, Seagrave JC，等(2011)Lewis大鼠慢性矽肺模型中纤维性和氧化还原相关但非促炎基因上调。有毒物质环境卫生杂志74:1261-1279。
28. Giordano G, van den Brule S, Re SL, Triqueneaux P, Uwambayinema F等(2010)I型干扰素信号通路促进了矽肺小鼠模型的慢性炎症。毒理学杂志116:682-692。
29. Pongrakhananon V, Wattanathamsan O, Takeichi M, Chetprayoon P, Chanvorachote P (2018) CAMSAP3的缺失通过修饰微管- akt机制促进EMT。中华细胞科学杂志32(5):561 - 561。
30. Honma K, Chiyotani K, Kimura K(1997)矽肺病，混合尘肺病和肺癌。美国医学杂志32:595-599。
31. Scheffler M, Bos M, Gardizi M, Konig K, Michels S等(2015)非小细胞肺癌(NSCLC)中PIK3CA突变:遗传异质性、预后影响和既往恶性肿瘤发生率。Oncotarget 6: 1315 - 1326。