欧米茄3和维生素D对新生儿大鼠宫内暴露于香烟烟雾中中枢神经系统损伤的保护作用

烟草(香烟)是一种物质，现在普遍使用，由于含有许多有毒物质，对机体的所有系统都有不利影响。另一方面，怀孕期间吸烟对母婴健康和培养健康的后代都是一个极其重要的问题。怀孕期间吸烟是最重要的可预防的危险因素，可能导致不良的妊娠结果。与怀孕期间吸烟数量的增加成正比，可能会出现先兆流产、妊娠高血压、先兆子痫、早产、胎儿生长受限、婴儿猝死综合征、不孕、胎盘消融、早期胎膜破裂、先天性畸形等并发症[1-3]。

吸烟者接触到许多化合物，如尼古丁、镉、铅和汞。吸烟会影响中枢神经系统(CNS)的生理、生化和行为功能。此外，怀孕期间暴露在香烟烟雾中还会导致产后发病率，表现为阅读和拼写成绩降低，以及儿童[4]学习成绩下降。事实上，这甚至与青少年的行为障碍有关。然而，也有研究表明，它会引起儿童精神方面的副作用、注意力缺陷、智力迟钝和儿科癌症[6,7]。

-3脂肪酸是重要的脂肪酸。它们不能在体内产生，只能随食物服用。它们进入细胞膜，高浓度存在于中枢神经系统和人脑中。它们有穿越血脑屏障的能力。人们早就知道-3脂肪酸对宫内期婴儿的认知和身体发育有良好的影响[8-10]。研究表明-3脂肪酸对神经系统的激活、记忆和认知功能的发展和改善以及学习能力[11]都有积极作用。如今，它已被纳入许多疾病的治疗指南，主要用于帮助治疗心血管疾病、注意缺陷-多动综合征和增强免疫系统[8,9]。

维生素D是一种重要的类固醇激素，具有钙止血的作用，众所周知，在许多不同的组织，如神经系统，除了骨代谢受体。孕妇孕期维生素D缺乏与风险增加有关，与不同系统的异常有关，主要是子痫前期、妊娠糖尿病、胰岛素抵抗、低出生体重、早产和胎儿骨骼系统[12]。已有研究表明，维生素D具有抗炎、抗微生物的特性，并在神经系统中发挥细胞增殖和分化的作用，具有神经保护作用。如今，维生素D被认为是一种神经类固醇，关于其在大脑中的不同功能的研究已经开始。

虽然已经进行了许多关于Omega - 3和维生素D的研究，但在发现这些维生素如何影响暴露在香烟烟雾中的胎儿中枢神经系统方面，研究还不够充分。需要更多的研究来确定这些影响。在本研究中，我们在生物化学水平和光学显微镜下，研究了香烟烟雾暴露对中枢神经系统的毒性作用以及欧米茄3和维生素D对这些毒性作用的保护作用。

本研究使用28只成年雌性怀孕Wistar-Albino大鼠。大鼠体重在150 ~ 200 gr之间。大鼠饲养在铁丝网网笼中，每笼7只妊娠大鼠。笼的尺寸为30*60*30 cm。大鼠在特定的环境中随意喂食饲料(饲料商店标准颗粒大鼠饲料)和自来水，调整为夜间12小时和白天12小时。保持正常室温(22±1℃)和湿度。大鼠的怀孕证实了坚实的，黄色的阴道斑块形成。阴道斑块的出现被认为是怀孕的第一天。

第一组老鼠是对照组。这可以确保老鼠交配后怀孕。母鼠自发观察，无需任何程序。出生后，婴儿被关在同一个笼子里，只用母乳喂养。我们让第二组大鼠在受孕后每天2小时通过喷雾器吸入10支香烟。同样，我们也让新生儿每天暴露在香烟烟雾中2小时。第三组妊娠大鼠受孕后给予香烟烟雾2小时/天+欧米茄3 (0.5 mg/kg/天)。我们把新生儿和母亲放在同一个环境中10天，我们确保他们只喝母乳，并暴露在香烟烟雾中。第四组妊娠大鼠给予吸烟2小时/天+维生素D(42微克/公斤/天)。我们把新生儿和母亲放在同一个环境中10天，我们确保他们只喝母乳，并暴露在香烟烟雾中。 We administered Vitamin D and Omega 3 intraperitoneally.

对胎儿进行宏观检查，以确定是否有任何异常或病理，并记录其体重。出生后第10天，给予新生儿氯胺酮麻醉，适当切口收集脑、脊髓组织送病理生化科。常规组织学组织追踪和石蜡块对这些组织进行处理。石蜡块制备5 ~ 6 μ m厚度的切片，用苏木精伊红、Caspase- 3和神经丝染色。免疫组化Caspase-3检测细胞凋亡，[7]神经丝染色检测神经组织退变和脱髓鞘。采用系统随机抽样的方法从各组中选取脑组织和脊髓组织制剂。

髓鞘脱失:缺失1分，部分脱髓鞘区2分，广泛脱髓鞘区3分。

变性:缺位1分，局部退变2分，广泛性退变3分。

细胞凋亡:缺1分，部分凋亡2分，广泛凋亡3分衔接:缺1分，部分衔接2分，广泛衔接3分。

以丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和荧光氧化产物(fluorescence Oxidation Products, FOU)水平为生化指标，在脑和脊髓组织中测定各组间氧化产物是否存在差异。采用Wasowicz所述的荧光法测定MDA水平。荧光氧化产物测定采用改良的Shimasaki法。简单地用乙醇-乙醚(3/1 v/v)提取组织匀浆，并在360/430(激发/发射波长)波长下用荧光光谱法测定。

连续变量的分布是否正态分布由Shapiro-Wilk检验决定。方差齐性评价采用Levene检验。数据表示为平均值±SD或中位数(四分位数范围)，如适用。组间均值差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，非正态分布数据的比较采用Kruskal Wallis检验。当单因素方差分析(One-Way ANOVA)或Kruskal Wallis检验统计的p值具有统计学意义时，采用事后Tukey HSD或Conover的多重比较检验来了解哪组与其他组不同。使用IBM SPSS统计17.0版本软件(IBM公司，Armonk, NY, USA)进行数据分析。p值小于0.05被认为有统计学意义。

在分析中，从组中获得的胎儿数量进行了相关分析，组之间的差异被发现具有统计学意义。我们观察到，暴露于香烟烟雾组的胎儿数量显著减少(p < 0.001)。我们观察到，服用欧米茄3和维生素D组的胎儿数量增加，这个数字与对照组的胎儿数量相似。我们发现，在平均体重方面，各组之间有统计学上的显著差异(p < 0.001)，只有暴露在香烟烟雾中的组的胎儿体重显著较低。结果发现，对照组和服用欧米茄3和维生素D的组的胎儿体重相似。我们评估了胎儿的头部、身体和四肢畸形，我们没有发现组间有任何显著差异。另一方面，在脑组织和脊髓组织的组织病理学检查中，......我们观察到，与对照组相比，暴露于香烟烟雾组的MDA和FOU水平作为揭示氧化损伤的重要参数，升高具有统计学意义(p < 0.001)。我们检测到，暴露于香烟烟雾并同时给予Omega 3的组MDA和FOU水平较低(p < 0.001)。另一方面，观察到服用维生素D组MDA和FOU水平较低，但我们没有发现任何统计学意义。

各组脱髓鞘评分差异有统计学意义(p < 0.001)。香烟组(组2)、Omega-3组(组3)、维生素D组(组4)脱髓鞘评分均高于对照组(组1)，差异均有统计学意义(p < 0.001、p < 0.001、p=0.030)。与香烟暴露组相比，Omega-3和维生素D组脱髓鞘评分较低，差异均有统计学意义(p < 0.001和p < 0.001)。ω -3和维生素D组间差异无统计学意义(p=0.137)(表1和图1)。退化评分组间差异有统计学意义(p < 0.001)。香烟组(组2)、Omega-3组(组3)、维生素D组(组4)退行性变评分高于对照组(组1)，差异均有统计学意义(p < 0.001、p < 0.001、p=0.010)。欧米茄-3和维生素D组退行性变评分低于香烟暴露组，差异均有统计学意义(p=0.024和p < 0.001)。维生素D组退行性变评分低于Omega-3组，差异有统计学意义(p=0.018)(表1、图2)。

表1:关于组织病理学评估的频率分布。

注意:数据以病例数和(百分比)表示，†Kruskal Wallis检验，a:第1组vs第二组(p < 0.001)， b:第一组vs第三组(p < 0.05)， c:第一组vs第四组(p < 0.05)， d:第二组vs第三组(p < 0.05)， e:第二组vs组4 (p < 0.001)， f:组3vs第4组(p=0.018)。

图1:

图2:

细胞凋亡评分组间差异有统计学意义(p < 0.001)。与对照组(组1)相比，卷烟组(组2)和Omega-3组(组3)细胞凋亡评分均较高，差异均有统计学意义(p < 0.001和p = 0.030)。与香烟暴露组相比，Omega-3组和维生素D组细胞凋亡评分均较低，差异均有统计学意义(p < 0.001和p < 0.001)。对照组与维生素D组、Omega-3组与维生素D组差异无统计学意义(p=0.450、p=0.137)(表1、图3)。

图3:

在凝聚力评分方面，各组间差异有统计学意义(p < 0.001)。香烟组(组2)、欧米茄-3组(组3)和维生素D组(组4)的凝聚力得分均高于对照组(组1)，差异均有统计学意义(p < 0.001、p=0.037和p=0.037)。欧米茄-3和维生素D组的凝聚力得分分别低于香烟暴露组，差异均有统计学意义(p < 0.001, p < 0.001)。欧米茄-3和维生素D组之间差异无统计学意义(p=1.000)(表1和图4)。

图4:

众所周知，吸烟会导致脑组织的组织结构和功能发生变化。abreuo - villaca等研究人员指出，吸烟会在胎儿发育过程中造成细胞损伤，并阻止突触成熟和细胞间通讯。此外，他们还指出，尼古丁对发育年龄的大脑具有神经毒性。Slotkin等的研究表明，尼古丁的摄入可导致青春期啮齿类动物大脑皮层的神经元损伤。在本研究中，我们在暴露于香烟烟雾的大鼠前额叶皮层中观察到分子层空泡化和神经胶质细胞浸润。此外，检测到散在固缩细胞。总之，我们得到的有关吸烟暴露的研究结果与上述研究结果一致。在此前进行的这些研究中，暴露在香烟烟雾中的大鼠的肺、肝脏和睾丸组织中，脂质过氧化指标丙二醛(MDA)水平升高，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)值下降。研究表明，这些疾病可能是由于暴露在香烟中的氧化损伤造成的。大脑对氧化应激很敏感，因为它的耗氧率很高。 Additionally, it has been reported that the antioxidant defense system is weak in the brain, and that smoking leads to oxidative stress also in these tissues.

在实验研究中发现，给创伤性脑损伤大鼠注射1,25(OH)2 D3和孕酮后，创伤后炎症减轻，并证实其具有神经保护作用。解释维生素D的神经保护作用的另一个公认的机制是维生素D降低活性氧底物(ROS)的水平。研究表明1,25(OH)2D3可增强胶质细胞和神经元的抗氧化作用，降低死亡细胞的ROS。有人认为，维生素D不能仅仅被视为一种维生素，它在许多机制中也在大脑中发挥作用，因此，它的水平与一些神经疾病的发展密切相关。据证实，缺乏维生素D会在生命的各个阶段对大脑产生不良影响，可能导致帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症等。细胞色素P450酶系统之一的CY-维生素D在胶质细胞中的神经保护作用可能通过降低l型钙通道的表达或提高VDR水平来表现。因此，维生素D缺乏可以视为一个因素，增加形成神经疾病的风险。胚胎期VDR表达增加可能增加细胞凋亡，减少有丝分裂，影响细胞增殖，并可能在神经元发育过程中发挥重要作用。然而，大脑中的1,25(OH)2D3活性还不能完全了解。认为1,25(OH)2D3降低成神经细胞瘤的增殖，细胞分化增加时的活性机制是维生素D向其非活性代谢产物转化，减少增殖，保持平衡。 It is argued that 1,25(OH)2D3 has a strong regulatory effect in signal transduction of Neuron Growth Factor (NGF), which is especially apparent in developing neurons, and therefore, may be important in the development and the migration of neurons in the brain.

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