甲氯乙胺素与淀粉样β -肽对人肺癌细胞株H441的协同抗增殖作用

2020年，全球约有2000万新病例和1000万人死于[1]型癌症。最近的预测表明，从2015年到2065年，仅在美国就有400多万人死于肺癌。目前许多癌症的治疗使用了各种各样的化疗药物[3,4]。烷基化剂，更具体地说，氮芥化合物，是抗癌化疗药物的一部分。氮芥的高活性和细胞毒性特性导致了对原始化合物的多次修饰，目的是尽量减少广义毒性效应，并增加对特定癌细胞[5]的选择性和特异性。甲氯乙胺素(ME)是一种氮芥化合物，是一种抗肿瘤剂。ME作为烷基化剂，使两条DNA链交联，阻止DNA复制，导致细胞死亡[5,6]。ME的临床应用已经超过60年，经常与其他治疗药物配伍治疗多种癌症，如淋巴瘤、白血病、真性红细胞增多症和肺癌[5-7]。先前的研究发现ME对体外培养的A-431皮肤细胞在25 μ M[8]浓度时是有毒的。当用于神经母细胞瘤细胞培养时，10µM ME处理导致90%以上的细胞死亡[9]。 Further在体外细胞研究表明，10-20 μ M的ME处理造成了不可挽回的DNA损伤，导致不可逆的细胞周期阻滞[10]。与ME和ebselen或其他相关有机硒类似物联合治疗表明，当ME与其他治疗药物联合使用时，可降低其毒性。

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的痴呆症，全球有超过4400万人受其影响[11-14]。脑内淀粉样β肽(Aβ)的积累导致β-淀粉样斑块的形成。Aβ产生引起的神经炎症状态升高与AD的发生有关[13,14]。Aβ也被鉴定为抗菌肽(AMP)[15]。在体外对革兰氏阴性杆菌感染内皮细胞的研究表明，Aβ是在感染[16]后产生的。研究显示了Aβ的AMP特性，支持了导致Aβ产生增加的感染可能导致AD的理论。AMPs，包括Aβ，也被证明是抗癌肽(ACPs)，不仅可以杀死感染的宿主细胞，还可以杀死癌细胞[17-20]。这些特性使acp成为一个有趣的研究领域，因为它们可能作为抗增殖剂与化疗结合，以增强其疗效。

H441细胞(ATCC, HTB-174)是从人肺乳头状腺癌组织中分离得到的上皮细胞系。本研究以H441细胞为研究对象，测定了甲氯乙胺与β -淀粉样蛋白的协同抗增殖作用。当ME在很低的剂量下使用时，Aβ的抗增殖特性似乎增强了氯氯沙明的抗癌效果。

细胞培养:

H441细胞在完全生长培养基DMEM/Ham’s F-12 50/50中培养，添加l -谷氨酰胺和15 mM HEPES(康宁，10-092-CV)，添加10%体积胎牛血清(ThermoFisher, A3160402)，标准条件下(37℃，5% CO2湿度培养箱)。细胞定期传代培养以保持活性生长。

甲氯乙胺(ME)溶液制备:

从保护罐中取出固体盐酸甲氯沙明(Sigma Aldrich, 122564)粉末，在无血清DMEM/Ham的F-12 50/50培养基中制备1 mg/mL ME溶液。将溶液轻轻搅拌，直到粉末完全溶解。将均质溶液放入无菌的3ml鲁尔锁定注射器中，通过0.2 μm注射器过滤器进入无菌管中，对滤网进行消毒。该样品成为用于处理测定的原液。

β淀粉样蛋白(Aβ)肽溶液制备:

根据之前发表的协议[21]，3 mL 0.1 M NaOH和3 mL 1X PBS缓冲液经0.2 μ M注射器盘过滤灭菌。将过滤后的0.1 M NaOH的82.5 μL加入含1 mg a β(残基1 - 42)的小瓶中，用六氟-2-丙醇(HFIP) (Sigma-Aldrich, AG968-1MG)预处理。温和旋流使肽完全溶解，然后孵育15分钟。之后，加入2ml过滤过的PBS缓冲液，将得到的溶液混合，不受干扰，室温下放置24小时。然后将样品保存在4°C，直到进一步使用。

ME和/或Aβ治疗:

用血细胞计测定了H441细胞悬液的细胞浓度。在96孔板的每个测试孔中，在标准条件下，在200 μ L的完整生长培养基中培养15,000个细胞。第二天，对于ME或Aβ单独处理，通过向每口井中添加适当数量的制备的ME或Aβ溶液来达到预期的测试浓度。对于ME和Aβ的双重处理，每个孔的细胞孵育在含有0.2µM ME和2µM Aβ的培养基中。每个孔的总体积保持在200 μ L。处理后的细胞在标准条件下孵育72小时。在孵育期之后，对细胞进行计数，并确定每个孔中的细胞总数。

计数细胞:

每个孔中的细胞经过胰蛋白酶化，在75 μ L的培养基中重悬至单细胞悬浮液。然后将细胞悬液与等体积台盼蓝混合，孵育5分钟，以区分活细胞和死细胞。然后将混合物加载到血细胞计上，测定每个样本的活细胞浓度和总数量。

为了研究淀粉样β-肽是否能增强甲氯乙胺素的抗增殖作用，ME的使用浓度应足够低，并对细胞增殖有部分作用。为了确定如此低的ME浓度，研究了肺癌细胞系H441在不同浓度的ME存在下的增殖情况。初始测定的样品µM为0.0 μ M(对照样品)、2.5 μ M、5.0 μ M、10.0 μ M和20.0 μ M。在每次试验中，在96孔板的每孔中镀15,000个细胞。第二天，加入指定浓度的ME，在标准条件下培养72小时。然后，测定每个孔的细胞数量(图1)。观察到的效果是显著的和实质性的，即使是在2.5 M的MEµ。

由于2.5 μ M浓度的ME对H441细胞的增殖仍有显著影响，因此在更低浓度的ME, 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2.5 μ M下重复细胞试验。图2显示了ME暴露72小时后，每个孔中H441细胞的平均数量。在本试验中使用的最低代谢能浓度下，细胞数量比对照减少35%。ME的0.2 μ M浓度比报道的抑制细胞增殖的浓度低50 ~ 125倍，因为它对H441细胞增殖产生了合理的抑制作用，并提供了足够的范围来证明a β是否会增加这种作用，所以选择它作为未来的研究。

已有研究表明，Aβ 2µM对H441细胞的增殖也有抑制作用。为了检验Aβ是否能增强其抗增殖作用，我们分别使用2.0 μ M的Aβ和0.2 μ M的ME，并结合使用。按照ME处理H441细胞的相同方案，重复该试验5次。在72小时的治疗后，每孔中的平均细胞数量如图3所示。每个个体，ME或Aβ，在处理孔中减少了约30%的细胞数量(Aβ 33%， ME 30%)。所得结果经配对t检验，p值< 0.05有统计学意义。与单独处理相比，ME和a β联合处理导致细胞数量进一步减少。与未处理的对照组相比，有ME和Aβ处理的孔含有48%的细胞。如果ME本身的治疗被认为是100%的参照点，a β的添加会导致细胞数量额外减少25%。根据配对t检验，观察数据具有统计学意义，p值< 0.01。 These observations suggest that ME and Aβ can work together in suppressing cell proliferation, offering a viable option to explore in terms of finding less toxic, yet effective ways of suppressing cancer cell proliferation.

图1:甲氯胺浓度对H441细胞数量的依赖性作用．H441细胞在标准条件下用指定的ME浓度处理72小时。在孵育之后，确定每孔中的细胞数量。柱状图表示4次试验中每个孔的平均细胞数。每一项试验都重复进行。误差条表示相应的实验误差，计算为平均的标准误差(SEM)。

图2:甲胺素浓度对H441细胞数量的依赖效应，在较低的代谢能浓度下。H441细胞在标准条件下用指定的ME浓度处理72小时。在孵育之后，确定每孔中的细胞数量。柱状图表示4次试验中每个孔的平均细胞数。每一项试验都重复进行。误差条表示相应的实验误差，计算为平均的标准误差(SEM)。0.2µM与未处理的(0.0µM)对照组细胞数的百分比差异也被指定。

图3:ME和Aβ单独及联合处理对H441细胞数量的影响。在标准条件下，用指定的ME和/或Aβ浓度处理H441细胞72小时。然后，确定每个孔中的细胞数量。柱状图表示每孔的平均细胞数，来自5次试验，其中每项试验都是重复进行的。误差条表示相应的实验误差，计算为平均的标准误差(SEM)。还指定了两个不同样本之间的百分比差异和相应的统计显著性p值。p值采用配对t检验计算。

甲氯乙胺素的抗癌特性和相关的ME治疗的高毒性已经被证实。正因为如此，在提供充分治疗的同时降低毒性的任何努力都被认为是有价值的。近年来，Aβ的抗增殖作用已被揭示。因此，ME和Aβ可以通过使用较低的剂量来提供充分的细胞增殖抑制，但同时减少副作用，这是合理的。为了研究ME和Aβ是否能协同抑制细胞增殖，本研究使用了10 - 25 μ M浓度的ME和Aβ。

结果表明，在0.2µM ME的条件下，培养的H441细胞数量减少30%，比报道的处理浓度低50 ~ 125倍。然后将这种极低浓度的ME与a β结合使用，也显示出在2µM浓度时具有类似的抗增殖效果。当低剂量ME与Aβ联合使用时，细胞数量较未处理对照组进一步减少。单独处理导致处理细胞数量减少约30%，而ME和a β联合处理导致48%的减少。单独的治疗在结合时并不完全是相加的，但我们的结果表明，它们在功能上是互补的。这些观察结果有力地表明，低剂量的ME与Aβ结合时，可获得有效的抗癌治疗结果。这些发现也表明Aβ在与其他化疗药物联合使用时具有潜在的协同作用。

Aβ抗增殖作用的机制及其与ME协同作用的具体机制有待进一步研究。[22]表明，Aβ抑制ABC转运蛋白的功能，该转运蛋白可以从干细胞、祖细胞和癌细胞中驱逐外来分子，包括药物制剂，增加它们的生存和持续增殖。很可能是通过抑制ABC转运蛋白，Aβ增加了ME的治疗效果，从而进一步减少了本研究观察到的处理细胞数量。研究Aβ在支持其他抗癌疗法方面的潜力将是有趣的。

考虑到a β在阿尔茨海默病发展中的作用，使用a β作为治疗的潜在副作用也应该进行研究。

这项工作得到了夏威夷杨百翰大学提供的研究基金的支持。

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