T细胞培养基中添加胎牛血清可扩增牛血清白蛋白特异性人CD4⁺T细胞

抗原CD4⁺T细胞有可能维持对病原体和癌症的有效免疫反应。在对癌症的反应中，肿瘤特异性CD4⁺T细胞分泌白细胞介素2 (IL-2)，维持肿瘤特异性CD8的生存和功能⁺T细胞或上调CD40配体，使专业抗原提呈细胞(APCs)成熟并激活CD8⁺T细胞[1,2]。此外，肿瘤浸润性CD4⁺T细胞也表达多种效应分子/细胞溶解分子[3]，提示其直接效应功能。事实上，肿瘤抗原特异性CD4的过继转移⁺T细胞成功根除黑色素瘤[4]。此外，抗原特异性CD4的过继转移⁺调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)不断表达转录因子Foxp3，被认为是治疗自身免疫性疾病的一种有前景的免疫疗法[5,6]。

为了监测疫苗接种或免疫治疗后的T细胞反应，临床试验通常需要长期培养大量抗原特异性T细胞。然而，开发最佳抗原特异性T细胞培养系统一直是临床监测T细胞反应的主要挑战。抗原特异性T细胞常由特异性抗原脉冲APCs扩增。有趣的是，APCs在被感兴趣的抗原脉冲之前，通常会接触到各种无关的抗原，包括从胎牛血清(FCS)中提取的抗原，后者被补充到细胞培养或细胞分离培养基中[7-12]。因此，APCs极有可能捕获这些抗原并将其呈现给T细胞。

在这项研究中，我们发现人类的CD4⁺用Epstein-Barr病毒(EBV)转化的自体B细胞(BCLs)在含10% FCS (RF10)的RPMI 1640培养基中激活来自健康供体PBMCs(外周血单个核细胞)的T细胞。我们使用在含FCS或不含FCS的培养基中维持的APCs进行了细胞内细胞因子产生实验，以确定抗原的FCS来源。我们最终确定了血清蛋白牛血清白蛋白(BSA)作为激活其特异性CD4的抗原⁺T细胞。使用抗HLA(人类白细胞抗原)抗体和匹配单个供者HLA分子的BCL组，我们能够定义这些HLA- drb1 *01:01-和HLA- dpb1 *03:01-限制性CD4⁺T细胞反应。最后,在体外刺激这些CD4⁺合成重叠的BSA多肽覆盖了整个BSA氨基酸(aa)序列，使我们能够鉴定出两个HLA-DRB1*01:01-限制性抗原表位。

我们的数据首次证明了在含FCS培养基中培养的APCs可以加工牛血清白蛋白，并将其抗原肽提交给人类CD4细胞⁺在T细胞免疫治疗的临床试验监测中，这可能是一个值得关注的问题。

道德声明

根据协议12-07VIC-17从澳大利亚红十字会血液服务中心(澳大利亚墨尔本)获得健康献血者的血袋。该研究得到了拉筹伯大学人类伦理委员会的批准，项目编号为FHEC12/NR81。

抗体和合成肽

荧光标记小鼠抗人CD3 (V450)、CD4 (APC)、CD107a (FITC)、IFN-γ (FITC或PerCP-Cy5.5)、IL-2 (PE)、TNF-α (PE- cy7)单抗购自BD Biosciences(美国)。抗rvv rna结合蛋白抗体TW2.3[13]是来自Jonathan Yewdell博士和Jack Bennink博士(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD)的礼物。通过Mimotopes (Clayton, Victoria, Australia)合成了具有6-aa移位的18-重叠的BSA蛋白作为剪切pin多肽(肽序列见补充表1)。将所有多肽溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并在-20°C保存直至使用。

PBMC隔离

人体pbmc通过Ficoll-Paque分离分离并保存在液氮中直到使用。所有的献血者都是由维多利亚移植和免疫遗传学服务(墨尔本，澳大利亚)分型的HLA。

细胞培养

BCLs通过标准EBV转化产生，并在RF10 [RPMI 1640培养基(Gibco, USA)中添加10% FCS (Hyclone, USA)、50 μM 2-巯基乙醇(Gibco, USA)和100 U/mL青霉素-链霉素(Gibco, USA)]培养。CD4⁺通过流式细胞术细胞分选从人PBMCs中分离的T细胞在含有1×丙酮酸钠(Gibco, USA)、1×非必需氨基酸(Gibco, USA)和20 U/mL重组人白细胞介素2 (rhIL-2) (PeproTech, USA)的RF10中培养。对于T细胞的刺激和扩张，静息CD4⁺用照射过的BCLs按10:1的比例刺激T细胞，每隔一天或培养基变黄时更换细胞培养基。

rvv - ebv感染的BCL裂解物的制备

将BCLs接种于24孔细胞培养板，在含0.1% BSA的200 μL磷酸盐缓冲盐水(Sigma-Aldrich, USA)中，用表达EBV潜伏抗原(EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA-LP、LPM1和LMP2)的重组痘苗病毒(rVV)感染[14]，在37℃下，MOI为20次，感染1 h。随后加入1.8 mL RF-10，在37°C和5% CO孵育一夜₂．将感染的BCLs制成球团，用8 M尿素[15]裂解。然后将裂解液匀引并保存在-20°C直至使用。

细胞染色及流式细胞术

T细胞中TNF-α、IL-2和IFN-γ的细胞内染色，T细胞单独培养或与带或不带肽(10µg/mL)的APCs在10µg/mL brefeldin A (BFA)存在下共培养5小时(Sigma-Aldrich, USA)。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞一次，在4°C下对表面标记CD3和CD4染色30分钟，在室温下用1%多聚甲醛(PFA)固定20分钟，用2%皂素透性，并用单克隆抗体对TNF-α、IL-2和IFN-γ进行染色。CD107a染色时，在莫能菌素和抗CD107a抗体的存在下，在37℃抗原刺激5h后收集T细胞，用抗cd3和抗cd4单克隆抗体染色。对于T细胞受体(TCR) Vβ (Vβ)链染色，使用TCR Vβ保留库试剂盒(Beckman Coulter Life Sciences, USA)在4°C下用Vβ抗体染色30分钟，静置T细胞。染色后，在FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson, USA)上获取样品。使用FlowJo软件(FlowJo VX, Ashland, OR, USA)分析数据。

细胞分类

CD4休息⁺T细胞在4°C条件下用Vβ抗体染色30分钟，然后使用BD FACSAria III细胞分选器对Vβ阳性细胞进行流式细胞术分选。分选细胞纯度为>95%。

HLA限制分析

用泛HLA-II特异性抗体阻断自体BCLs, 4℃30 min后与T细胞共培养，以确定HLA-II等位基因的呈现情况。另外，HLA-II限制是通过抗原呈递测定，使用部分匹配或不匹配的HLA-II等位基因APCs。

响应细胞CFSE标记

应答器Vβ1⁺CD4⁺用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE) [20] (Thermo Fisher, USA)标记T细胞，然后与PBMC共培养，以与CD4细胞分化⁺T细胞来自添加的PBMC。简单地说，用PBS将CFSE稀释成0.08 μM的染色液。Vβ1⁺CD4⁺然后将T细胞重悬在1ml溶液中，在37°C孵育10分钟。加入等量的热灭活FCS，使标记淬灭。CFSE-labelled Vβ1⁺CD4⁺T细胞用PBS洗涤3次，在RPMI-1640培养基中重悬直至使用。

统计分析

使用Prism 8 (GraphPad Software)进行统计分析。组间有统计学意义的差异由学生决定t以及:* * *P< 0.001, * * * *P< 0.0001。误差条表示平均值的标准误差。

在含FCS培养基中培养的BCLs能激活并扩大CD4细胞的数量⁺来自健康供者外周血单核细胞的T细胞

为了克服获得自体APCs的困难，通常建立ebv转化的BCLs。这样的BCLs可用于繁殖特异性抗原的自体T细胞。在本研究中，来自健康供体(2013donor5)的BCLs被生成，并与自体PBMCs在RF10中共培养作为对照组。引人注目的是，在没有额外抗原的情况下，BCLs能够扩大自体CD4细胞⁺T细胞，如CD3快速下调和CD107a上调刺激CD4⁺再刺激5 h后的T细胞(图1A-1B)。此外，活化的CD4⁺T细胞在培养中形成簇状(图1C)，这是抗原特异性T细胞被激活后典型的形态变化。我们进一步研究了这些CD4刺激后TNF-α、IL-2和IFN-γ产生的谱⁺T细胞和自体BCLs。很明显，几乎所有产生IL-2的T细胞TNF-α都呈阳性(图1D-1E)。当该分析扩展到IFN-γ时，数据显示几乎所有产生IFN-γ的细胞也产生TNF-α和IL-2(图1D -1E)。这表明不同的TNF-α > IL-2 > IFN-γ细胞因子层次结构，与之前在小鼠系统中观察到的经典IFN-γ > TNF-α > IL-2细胞因子层次结构形成对比[16,17]。综上所述，这些数据表明，在含fcs的培养基中培养的自体BCLs可以触发一定的CD4⁺T细胞从PBMCs增殖并产生TNF-α， IL-2和IFN-γ在不同的细胞因子层次。

图1在含FCS培养基中培养的自体BCLs能激活人CD4⁺T细胞。(A)流式细胞术CD4门控⁺受fcs暴露的自体BCLs刺激的T细胞(下)或(上)。CD4 T细胞根据其细胞表面CD3和CD4的表达进行门控。(B)直方图和柱状图显示未受刺激和受刺激CD4细胞中CD3或CD107a表达水平⁺T细胞，抗体同型对照显示。学生t检验:***P <0.001， ****P < 0.0001，差异有统计学意义。误差条表示平均值的标准误差。(C) CD4⁺暴露于fcs的自体BCLs刺激培养后，T细胞形成簇。(D) CD4细胞的代表性FACS图⁺T细胞刺激后产生TNF-α、IL-2和IFN-γ。(E)受刺激的CD4⁺T细胞在TNF-α > IL-2 > IFN-γ的细胞因子层级中产生TNF-α、IL-2和IFN-γ。

CD4⁺在FCS中，T细胞对BSA有特异性反应

接下来，我们试图识别这些CD4识别的潜在抗原⁺T细胞。FCS是BCLs在培养基中接触的主要可溶性蛋白来源，因此首次检测FCS。为了了解fcs来源的抗原提呈动力学，将在含fcs培养基中培养的BCLs转移到不含fcs培养基(AIM-V) (Gibico, USA)中，每天4天，第7天监测其对应答CD4的跟踪抗原提呈⁺T细胞。正如预期的那样，抗原呈递逐渐减少，4天后达到基线(补充图1A)。因此，BCLs在AIM-V培养基中培养4天，然后转入含有2倍稀释FCS的AIM-V培养基中。一夜孵育后，BCLs与CD4共培养⁺然后评估T细胞的产生TNF-α和IL-2，这些CD4产生的细胞因子最丰富⁺T细胞。显然，BCLs刺激了CD4⁺T细胞以fcs剂量依赖的方式产生TNF-α和IL-2(图2A和2C)，表明CD4⁺T细胞识别fcs衍生抗原。我们进一步检测了最丰富的血清蛋白——牛血清白蛋白(BSA)。有趣的是，一些CD4细胞⁺在含有bsa的AIM-V培养基中，BCLs以bsa剂量依赖性的方式培养过夜，刺激T细胞(图2B和2D)。值得注意的是，在含有0.625-1.25% BSA的AIM-V培养基中培养的BCLs能够刺激CD4⁺在含有10% FCS的AIM-V培养液中，T细胞对BCLs的反应与BCLs相同，表明BSA是BCLs捕获、加工并传递给这些CD4细胞的蛋白⁺T细胞。考虑到BSA和人血清白蛋白(HSA)的氨基酸序列[18]相似性达76%，我们还检测了CD4⁺T细胞对人血清(HS)的反应。首先，BCLs在AIM-V培养基中培养4或7 d，然后在AIM-V培养基中添加10% HS过夜。CD4⁺T细胞与BCLs共培养，细胞内染色TNF-α。不出所料，这些bsa特异性CD4⁺T细胞对HSA没有反应(补充图1B)。

由于BCLs是通过标准EBV转化产生的，因此潜在蛋白中的EBV抗原仍有可能被提交到特定的CD4细胞中⁺据报道，T细胞作为内源性EBV抗原由II类分子[19]提出。为了验证这一假设，我们用8个编码EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA-LP、LPM1和LMP2的rvv感染BCLs[14, 20](补充图2A)。然后收集感染的BCLs并裂解作为可溶性抗原来源。BCLs在AIM-V培养基中培养4天后与EBV抗原共孵育一夜，然后与CD4细胞共培养⁺T细胞。有趣的是，BCLs呈现的EBV潜伏蛋白衍生抗原不能激活CD4细胞⁺T细胞(补充图2B)，表明这些CD4⁺T细胞不具有EBV特异性。一株携带HLA-DR*01:01的无ebv黑色素瘤细胞株MEL-14进一步证实了这一点，该细胞株能够刺激这些CD4细胞⁺只有提供抗原时，T细胞才能产生TNF-α(补充图3A-3B)。总之，这些结果表明自体bcl -扩增CD4⁺T细胞对BSA具有特异性。

补充图1:在不含fcs或含hs的培养基中培养的自体BCLs不能刺激fcs特异性CD4⁺T细胞。(A) CD4中TNF-α的产生⁺无fcs培养基培养的自体BCLs刺激后的T细胞。BCLs在含fcs培养基(第0天)或不含fcs培养基AIM-V中培养7天，然后用于刺激fcs特异性CD4⁺T细胞。(B) CD4⁺T细胞对fcs或hs暴露的自体BCLs产生TNF-α。自体BCLs在含fcs培养基中培养(第0天)，或在AIM-V培养基中培养4或7天(“第4天+ 10% HS”或“第7天+ 10% HS”)后CD4⁺T细胞的刺激。无显示未刺激的CD4中产生TNF-α⁺T细胞单独培养(A和B)。

补充图2:CD4⁺T细胞对EBV抗原没有反应。(A) rVV-EBV感染自体BCLs。用8个编码EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA-LP、LPM1和LMP2的rVV编码的EBV潜伏期蛋白感染自体BCLs。具有代表性的FACS图显示了抗rvv rna结合蛋白抗体TW2.3识别的感染细胞百分比。(B)未受刺激的CD4中TNF-α的产生⁺T细胞(无)和CD4细胞⁺用fcs暴露的自体BCLs或用rvv - ebv感染的BCL裂解液脉冲的自体BCLs刺激T细胞。

图2:CD4⁺T细胞产生TNF-α和IL-2以剂量依赖的方式响应FCS和BSA。AIM-V培养基培养的自体BCLs在含不同FCS或BSA浓度的培养基中培养一夜，刺激CD4⁺T细胞通过ICS计数。(A和B)未受刺激的CD3 (Nil)和受刺激的CD3中TNF-α和IL-2表达的代表性FACS图⁺CD4⁺T细胞。(C、D) TNF-α百分率⁺受刺激的CD3细胞⁺CD4⁺T细胞。

补充图3。CD4⁺fcs暴露的表达HLA-DRB1*01:01-的同种异体黑色素瘤细胞系可以刺激T细胞。(A) HLA-DR和HLA-DP分子在自体2013donor5 BCLs或两个同种异体黑色素瘤细胞系(MEL-14和MEL-17)上的表达。(B)未刺激CD4细胞中TNF-α产生的FACS图⁺T细胞(无)和CD4细胞⁺T细胞被fcs暴露的自体BCLs、MEL-14或MEL-17或抗hla - dr抗体处理的MEL-14刺激。

bsa特异性CD4的反应⁺T细胞是HLA-DRB1*01:01-和HLA-DPB1*03:01-限制性的

首先，我们使用抗泛HLA II类分子HLA- dr、-DP和-DQ的抗体进行了HLA阻断试验，以确定CD4反应的分子⁺T细胞受到限制。结果表明，anti-HLA-DQ对CD4细胞无抑制作用⁺T细胞反应(图3A)。然而，这种反应明显被Anti-HLA-DR和-DP抗体阻断(图3A)，表明大量CD4⁺T细胞应答受HLA-DR和-DP限制。接下来，我们确定了限制性HLA-DR和-DP等位基因。由于自体BCLs表达HLA-DRB1*01:01, 03:01和HLA-DPB1*03:01, 04:01，一组BCL系，包括9003 (HLA-DRB1*01:01;Hla-dpb1 *02:01, 13:01)， 9022 (hla-drb1 *03:01;HLA-DPB1 * 03:01), 9040 (HLA-DRB1 * 11;HLA-DPB1 * 03:01), 9053 (HLA-DRB1 * 13:02;和9080 (HLA-DRB1*01:01;HLA-DPB1*04:01, 04:02)与自体BCLs共享一个或两个等位基因，在RF10中生长并用于刺激体积CD4⁺T细胞(图3B)。显然,CD4⁺9003、9022、9040和9080而不是9053刺激T细胞分泌TNF-α和IL-2(图3C)，抗体阻断9003和9080上的HLA-DR分子和9022和9040上的HLA-DP分子几乎完全阻碍了它们刺激T细胞细胞因子产生的能力(图3D)。这些加在一起表明大量的CD4⁺T细胞的反应是HLA-DRB1*01:01-和HLA-DPB1*03:01-受限的。

图3:的反应CD4⁺T细胞对BSA的限制是HLA-DRB1*01:01和HLA-DPB1*03:01。(一)肿瘤坏死因子-α的百分比⁺, - 2⁺和干扰素-γ⁺在未受刺激和受刺激的CD3细胞之间⁺CD4⁺T细胞。CD3⁺CD4⁺经处理或抗hla - dr、抗hla - dp抗体处理、fcs暴露的自体BCLs刺激T细胞。(B) HLA-DR, DP分子在自体BCL (2013donor5)和其他5个同种异体BCL系(9003,9022,9040,9053,9080)上表达。(C) CD3中TNF-α和IL-2产生的代表性FACS图⁺CD4⁺自体和同种异体BCLs刺激后的T细胞。(D) CD3刺激后产生细胞因子的细胞(TNF-α和IL-2单阳性和双阳性细胞)的百分比⁺CD4⁺T细胞。

缩小多克隆体CD4的范围⁺T细胞数量可能更均匀，美国Beckman Coulter生命科学公司使用TCR Vβ保留试剂盒来评估T细胞数量，如图4A所示。然后通过细胞分选分离出较大的Vβ群体，包括Vβ16、Vβ1和Vβ14，用fcs暴露的自体BCLs刺激，并在细胞内染色TNF-α和IL-2。与体积CD4相比⁺T细胞应答，Vβ1和Vβ14，但不包括Vβ16，能够对自体BCLs做出同等程度的应答(图4B)。因此，我们集中研究了Vβ1群体，其中抗原特异性T细胞最丰富(图4A-4B)。引人注目的是,CD4⁺表达Vβ1的T细胞在9003和9080而不是9022的刺激下产生细胞因子(补充图4)⁺T细胞只局限于HLA-DRB1*01:01。图4:fcs暴露的自体BCLs刺激CD4+ T细胞的多克隆扩增。(A)静息体CD4中TCR Vβ群体的FACS图⁺T细胞。(B)未刺激的体积CD4中TNF-α和IL-2的产生⁺T细胞(无)和受刺激的体积CD4⁺T细胞和Vβ1、Vβ14、Vβ16群体。

补充图4:Vβ1⁺CD4⁺HLA-DRB1*01:01限制了T细胞对BSA的应答。FACS图显示未受刺激(Nil)或受刺激的体积CD4中TNF-α的产生⁺T细胞和Vβ1⁺CD4⁺T细胞。T细胞被fcs暴露的自体BCLs (2013D5)或fcs暴露的表达HLA-DRB1*01:01(9003,9080)或HLA-DPB1*03:01(9022)，或不表达分子(9010)的同种异体BCLs刺激。

bsa衍生HLA-DRB1*01:01-restricted CD4的鉴定⁺T细胞抗原表位

接下来，我们重点鉴定HLA-DRB1*01:01-限制性BSA表位(s)。将101条合成的18-mer BSA多肽(补充表1)，以12个aa重叠，分别脉冲到aim - v生长的DRB1*01:01-表达9003个BCLs。用肽脉冲9003 APCs刺激体积CD4⁺T细胞。在101条筛选的多肽中，BP27 (BSA_{157 - 174}FWGKYLYEIARRHPYFYA)刺激主要的TNF-α⁺BP2 (BSA)引起的响应较小_7-24， ISLLLLFSSAYSRGVFRR)(图5A)，分离到的Vβ1也证实了类似的结构⁺CD4⁺T细胞(图5B)， Vβ1 T细胞对BSA的反应是可滴定的(图5C)。为了排除长期培养可能在某种程度上偏向某些T细胞群的可能性，我们分离出了Vβ1⁺CD4⁺T细胞来自自体PBMCs体外，用CFSE标记，用多肽脉冲自体PBMCs刺激。我们的数据表明，BP27和bp2特异性CD4⁺在Vβ1群体中，T细胞很容易被检测为显性和亚显性反应(图5D)，它们对BSA的反应是可滴定的(图5E)。总的来说，我们发现了两个BSA 18-mer多肽，可能包含一个显性和一个亚显性HLA-DRB1*01:01-restricted CD4⁺T细胞抗原表位。

图5:bsa特异性HLA-DRB1*01:01-restricted CD4的鉴定⁺T细胞抗原表位。(A, B, D) CD4⁺T细胞对合成BSA重叠肽的反应。条形图显示TNF-α的百分比⁺体积CD4细胞间⁺T细胞(A)或Vβ1⁺CD4⁺单个肽脉冲同种异体BCLs(9003)或cfse标记的Vβ1刺激后的T细胞(B)⁺CD4⁺肽脉冲自体pbmc (2013Donor5)刺激后的T细胞(D)。FACS图显示未刺激的T细胞(仅T细胞)、AIM-V中培养的bcl刺激(Nil)、fcs暴露的bcl刺激(RF10)或肽脉冲AIM-V中培养的bcl刺激(BP2和BP27)中产生TNF-α细胞。(C、E) Vβ1产生TNF-α⁺CD4⁺T细胞对9003 BCLs (C)或自体PBMCs (E)有反应。9003 BCLs (C)和自体PBMCs (E)在含有两倍稀释BSA的AIM-V培养基中培养一夜，然后用于刺激T细胞。FACS图显示T细胞中TNF-α的表达。折线图显示TNF-α的百分比⁺CD4细胞总数中⁺T细胞。

接下来，我们试图预测BP27内的最小表位。BSA和HSA aa序列比对显示，BP27共有16个aa (F工作组BSA和F吉隆坡KYLYEIARRHPYFYA (HSA)(补充图5和补充表2A)。由于HSA未能激活我们的T细胞系，因此我们认为BSA 158和159位点的W和G是表位的关键部分。进一步，作为两个相邻的肽BP26 (BSA_{151 - 168})和BP28 (BSA_{163 - 180})也未能激活T细胞系，因此我们认为只有BP27包含最小表位(Supplementary table 2B)。有趣的是，在线表位预测工具:http://www.syfpeithi.de/index.html预测表位#39 (BSA_{159 - 173}BSA; BSA_{158 - 172}， WGKYLYEIARRHPYF)在BP27序列内(补充表2C)。基于以上结果，我们认为是BSA_{158 - 172}是最可能的最小表位，因为W是首选的氨基-锚基残基(补充表2D)。同样,# 35 (BSA)_7-21ISLLLLFSSAYSRGV)是BP2中唯一的预测表位(补充表2C)。

牛和人血清白蛋白氨基酸序列比对

补充图5:BSA和HSA aa序列比对。从NCBI蛋白数据库中收集BSA和HSA aa序列(alb -牛和alb -人)。BSA的GeneID为280717,HSA的GeneID为213。

1. *(星号)表示具有单个完全保守剩余的位置。
2. A:(冒号)表示具有强烈相似性的组之间的守恒-在Gonnet PAM 250矩阵中评分> 0.5。
3. A.(周期)表示弱相似属性组之间的守恒-在Gonnet PAM 250矩阵中评分≤0.5。

肽。	氨基酸 位置在BSA	合成BSA 肽序列	肽。	氨基酸 位置在BSA	合成BSA 肽序列
1	队	MKWVTFISLLLLFSSAYS	52	307 - 324	LEKSHCIAEVEKDAIPEN
2	7-24	ISLLLLFSSAYSRGVFRR	53	313 - 330	IAEVEKDAIPENLPPLTA
3.	13-30	FSSAYSRGVFRRDTHKSE	54	319 - 336	DAIPENLPPLTADFAEDK
4	19-36	RGVFRRDTHKSEIAHRFK	55	325 - 342	LPPLTADFAEDKDVCKNY
5	25-42	DTHKSEIAHRFKDLGEEH	56	331 - 348	DFAEDKDVCKNYQEAKDA
6	31-48	IAHRFKDLGEEHFKGLVL	57	337 - 354	DVCKNYQEAKDAFLGSFL
7	37-54	DLGEEHFKGLVLIAFSQY	58	343 - 360	QEAKDAFLGSFLYEYSRR
8	43-60	FKGLVLIAFSQYLQQCPF	59	349 - 366	FLGSFLYEYSRRHPEYAV
9	49 - 66	IAFSQYLQQCPFDEHVKL	60	355 - 372	YEYSRRHPEYAVSVLLRL
10	55 - 72	LQQCPFDEHVKLVNELTE	61	361 - 378	HPEYAVSVLLRLAKEYEA
11	61 - 78	DEHVKLVNELTEFAKTCV	62	367 - 384	SVLLRLAKEYEATLEECC
12	67 - 84	VNELTEFAKTCVADESHA	63	373 - 390	AKEYEATLEECCAKDDPH
13	73 - 90	FAKTCVADESHAGCEKSL	64	379 - 396	TLEECCAKDDPHACYSTV
14	79 - 96	ADESHAGCEKSLHTLFGD	65	385 - 402	AKDDPHACYSTVFDKLKH
15	85 - 102	GCEKSLHTLFGDELCKVA	66	391 - 408	ACYSTVFDKLKHLVDEPQ
16	91 - 108	HTLFGDELCKVASLRETY	67	397 - 414	FDKLKHLVDEPQNLIKQN
17	97 - 114	ELCKVASLRETYGDMADC	68	403 - 420	LVDEPQNLIKQNCDQFEK
18	103 - 120	SLRETYGDMADCCEKQEP	69	409 - 426	NLIKQNCDQFEKLGEYGF
19	109 - 126	GDMADCCEKQEPERNECF	70	415 - 432	CDQFEKLGEYGFQNALIV
20.	115 - 132	CEKQEPERNECFLSHKDD	71	421 - 438	LGEYGFQNALIVRYTRKV
21	121 - 138	ERNECFLSHKDDSPDLPK	72	427 - 444	QNALIVRYTRKVPQVSTP
22	127 - 144	LSHKDDSPDLPKL-KPDPN	73	433 - 450	RYTRKVPQVSTPTLVEVS
23	133 - 150	SPDLPKL-KPDPNTLCDEF	74	439 - 456	PQVSTPTLVEVSRSLGKV
24	139 - 156	L-KPDPNTLCDEFKADEKK	75	445 - 462	TLVEVSRSLGKVGTRCCT
25	145 - 162	TLCDEFKADEKKFWGKYL	76	451 - 468	RSLGKVGTRCCTKPESER
26	151 - 168	KADEKKFWGKYLYEIARR	77	457 - 474	GTRCCTKPESERMPCTED
27	157 - 174	FWGKYLYEIARRHPYFYA	78	463 - 480	KPESERMPCTEDYLSLIL
28	163 - 180	YEIARRHPYFYAPELLYY	79	469 - 486	MPCTEDYLSLILNRLCVL
29	169 - 186	HPYFYAPELLYYANKYNG	80	475 - 492	YLSLILNRLCVLHEKTPV
30.	175 - 192	PELLYYANKYNGVFQECC	81	481 - 498	NRLCVLHEKTPVSEKVTK
31	181 - 198	ANKYNGVFQECCQAEDKG	82	487 - 504	HEKTPVSEKVTKCCTESL
32	187 - 204	VFQECCQAEDKGACLLPK	83	493 - 510	SEKVTKCCTESLVNRRPC
33	193 - 210	QAEDKGACLLPKIETMRE	84	499 - 516	CCTESLVNRRPCFSALTP
34	199 - 216	ACLLPKIETMREKVLASS	85	505 - 522	VNRRPCFSALTPDETYVP
35	205 - 222	IETMREKVLASSARQRLR	86	511 - 528	FSALTPDETYVPKAFDEK
36	211 - 228	KVLASSARQRLRCASIQK	87	517 - 534	DETYVPKAFDEKLFTFHA
37	217 - 234	ARQRLRCASIQKFGERAL	88	523 - 540	KAFDEKLFTFHADICTLP
38	223 - 240	CASIQKFGERALKAWSVA	89	529 - 546	LFTFHADICTLPDTEKQI
39	229 - 246	FGERALKAWSVARLSQKF	90	535 - 552	DICTLPDTEKQIKKQTAL
40	235 - 252	KAWSVARLSQKFPKAEFV	91	541 - 558	DTEKQIKKQTALVELLKH
41	241 - 258	RLSQKFPKAEFVEVTKLV	92	547 - 564	KKQTALVELLKHKPKATE
42	247 - 264	PKAEFVEVTKLVTDLTKV	93	553 - 570	VELLKHKPKATEEQLKTV
43	253 - 270	EVTKLVTDLTKVHKECCH	94	559 - 576	KPKATEEQLKTVMENFVA
44	259 - 276	TDLTKVHKECCHGDLLEC	95	565 - 582	EQLKTVMENFVAFVDKCC
45	265 - 282	HKECCHGDLLECADDRAD	96	571 - 588	MENFVAFVDKCCAADDKE
46	271 - 288	GDLLECADDRADLAKYIC	97	577 - 594	FVDKCCAADDKEACFAVE
47	277 - 294	ADDRADLAKYICDNQDTI	98	583 - 600	AADDKEACFAVEGPKLVV
48	283 - 300	LAKYICDNQDTISSKLKE	99	589 - 606	ACFAVEGPKLVVSTQTAL
49	289 - 306	DNQDTISSKLKECCDKPL	One hundred.	595 - 607	GPKLVVSTQTALA
50	295 - 312	SSKLKECCDKPLLEKSHC	101	590 - 607	CFAVEGPKLVVSTQTALA
51	301 - 318	CCDKPLLEKSHCIAEVEK

补充表1:合成18-mer BSA多肽。

a .合成的BP27序列与HSA中相应序列的比较

BP27 (BSA157 - 174）	FWGKYLYEIARRHPYFYA
HSA aa序列	FLKKYLYEIARRHPYFYA

B.合成BSA多肽BP26、BP27、BP28

肽。	氨基酸的位置	合成BSA肽序列
BP26	151 - 168	KADEKKFWGKYLYEIARR
BP27	157 - 174	FWGKYLYEIARRHPYFYA
BP28	163 - 180	YEIARRHPYFYAPELLYY

C. BP27合成及预测HLA-DRB1*0101限制性BSA表位

肽。	在BSA的地位	合成BSA肽序列
BP27	157 - 174	FWGKYLYEIARRHPYFYA
# 39	159 - 173	GKYLYEIARRHPYFY
# 59	158 - 172	WGKYLYEIARRHPYF
BP2	7-24	ISLLLLFSSAYSRGVFRR
# 35	7-21	ISLLLLFSSAYSRGV

D. HLA-DRB1*0101锚或辅助锚

位置
1	2	3.	4	5	6	7	8	9
Y			l		一个			l
V			一个		G			一个
l			我		年代			我
F			V		T			V
我			米		C			N
一个			N		P			F
米			问					Y
W

补充表2:(A)合成的BP27序列与HAS中相应序列的比较，(B)合成的BSA多肽BP26、BP27和BP28， (C)合成的BP27与预测的HLA-DRB1*0101限制性BSA表位，(D) HLA-DRB1*0101锚定或辅助锚定。

凭借我们在扩增和培养抗原特异性T细胞方面的专业知识，我们发现BCLs单独在含fcs的培养基中培养具有惊人的能力刺激自体CD4的激活和扩增⁺从人外周血单核细胞分离的T细胞。这促使我们识别CD4识别的抗原⁺T细胞。我们的数据表明，它是来自FCS成分BSA的抗原。在CD4鉴定中应用我们建立的规程⁺在T细胞表位中，我们鉴定出1个显性和1个亚显性HLA-DRB1*01:01-restricted CD4⁺BSA的T细胞表位。

据我们所知，这是人类CD4的第一个证据⁺T细胞对自然处理和呈现的FCS蛋白-，BSA-，衍生抗原的反应。这也是预测最低CD4细胞的第一份报告⁺BSA的T细胞表位。已有小鼠fcs特异性T细胞的报道[21,22]。然而，研究中没有发现fcs来源的抗原。此前有研究报道在含fcs的培养基中转染慢病毒的树突状细胞(dc)刺激了自体CD4⁺T细胞对FCS[23]的反应。然而，抗原(s)没有被鉴定出来。与本研究不同的是，我们证明了fcs特异性CD4⁺T细胞识别BSA呈剂量依赖性，当APCs在无血清/BSA培养基AIM-V中培养时，T细胞识别BSA的能力逐渐减弱。我们进一步证实了这些CD4不能识别人血清⁺并排除了ebv抗原特异性的可能性。最终，利用覆盖整个BSA序列的重叠肽，我们能够识别出CD4识别的两个HLA-DRB1*01:01-限制性BSA表位⁺T细胞。体CD4的刺激⁺合成重叠的BSA多肽的T细胞对BSA有明显的反应_{157 - 174}．体积CD4的反应⁺T细胞转化为BSA_7-24这个阶段还很小。考虑到多个tcrv，体积CD4使用β⁺因此，我们富集了Vβ1反应，其中明显含有容易检测到的亚显性CD4⁺BSA特异性T细胞群_7-24．重要的是，这种免疫优势层次结构随后得到了验证体外自体PBMCs，表明我们的在体外T细胞扩增并不会导致特定于这两个BSA抗原表位的T细胞的偏倚结果。这两个CD4⁺BSA的T细胞表位，尤其是免疫优势BSA_{157 - 174}我们在这里发现的可能被考虑用于基于表位的疫苗对抗牛肉过敏。然而，到目前为止，我们的发现还局限于DRB1*01:01-受限的表位。可能BSA中还有一些免疫优势T细胞表位受到其他HLA-I/II分子的限制，如本研究中出现的HLA-DPB1*03:01限制的T细胞表位，可能与牛肉过敏有关，因此未来有望被发现。

胞内细胞因子染色(Intracellular cytokine staining, ICS)一直是检测刺激后抗原特异性T细胞的标准方法[24,25]。活化抗原特异性T细胞产生的IFN-γ是最常见的检测细胞因子[15,17,26,27]。然而，我们的数据显示，活化的CD4⁺T细胞有利于TNF-α生成IL-2和IFN-γ， TNF-α > IL-2 > IFN-γ的细胞因子层次与小鼠CD8中确定的IFN-γ > TNF-α > IL-2的细胞因子层次有很大的不同⁺T细胞[17]，IFN-γ > IL-2 > TNF-α在人CD8中的表达⁺T细胞与IL-2 > IFN-γ > TNF-α的关系⁺T细胞[28-36]刺激后5-6小时。这增加了一些T细胞或T细胞群产生不同模式细胞因子的可能性。在我们的病例中，可能有一些T细胞是针对BSA的_{157 - 174}也能弱识别与DR*01:01相匹配的HSA肽。这种部分激活可能会改变细胞因子的产生。重要的是，我们的观察提醒了选择细胞因子来检测抗原特异性T细胞。在某些情况下，使用TNF-α作为读出细胞因子可能更准确。

总之，这项研究提供了第一个证据表明CD4⁺从人PBMCs中分离的T细胞可以在细胞培养中被FCS蛋白BSA衍生的抗原激活和扩增。将BSA抗原呈递到CD4细胞⁺T细胞为HLA-DRB1*01:01-和HLA-DPB1*03:01-限制性T细胞，鉴定出2个HLA-DRB1*01:01-限制性BSA表位。因此我们相信其他的CD4⁺来自BSA的T细胞表位可以由其他HLA-II等位基因呈现，更不用说其他来自fcs的抗原了。当FCS用于使用pbmc的人T细胞培养时，无论是在临床试验结果的免疫监测期间，还是直接用于免疫治疗时，这可能是一个值得关注的问题。

该项目由NHMRC向WC提供的567122项目赠款支持。

1. June CH(2007)过继T细胞癌治疗原则。中国临床医学杂志，2017,24(3):449 - 456。
2. Tay RE, Richardson EK,Toh HC(2021)重新探讨CD4的作用⁺T细胞在癌症免疫治疗中的作用:对旧范式的新见解。癌症基因28:5-17。
3. Cachot A, Bilous M, Liu YC, Li X, Saillard M，等(2021)肿瘤特异性细胞溶解性CD4 T细胞介导对人类癌症的免疫。Sci睡觉7。
4. Hunder NN, Wallen H, Cao J, Hendricks DW, Reilly JZ，等。(2008)自体CD4治疗转移性黑色素瘤⁺T细胞对抗NY-ESO-1。北英格兰医学358:2698-2703。
5. 多明哲- villar M, Hafler DA(2018)在自身免疫性疾病中的调节性T细胞。Nat immuno19: 665-673。
6. 张东，涂恩，Kasagi S, zzanvit P，陈强，等(2015)操纵调控性T细胞:治疗自身免疫的一种有前途的策略。免疫治疗7:1201 - 1211。
7. Canderan G, Gruarin P, Montagna D, Fontana R, Campi G, et al.(2010)体外诱导和维持对自体非小细胞肺癌特异性的人T细胞的有效策略。PLoS One 5: e12014。
8. Kayser S, Bobeta C, Feucht J, Witte KE, Scheu A，等(2015)ny - eso -1特异性CD4的快速生成⁺THELPER1细胞用于过继t细胞治疗。Oncoimmunology 4: e1002723。
9. Montagna D, Maccario R, Locatelli F, Rosti V, Yang Y，等人(2001)体外启动长期维持抗白血病人细胞毒性T细胞提示过继免疫治疗的一般程序。血98:3359 - 3366。
10. Riddell SR, Greenberg PD(1990)利用抗cd3和抗cd28单克隆抗体克隆和扩增人类抗原特异性T细胞。J免疫方法128:189-201。
11. Tsai V, Southwood S, Sidney J, Sakaguchi K, Kawakami Y，等。(1997)肽脉冲树突状细胞体外初次免疫鉴定GP100黑色素瘤相关肿瘤抗原的次优势CTL表位。免疫学报158:1796-1802。
12. Yee C, Savage PA, Lee PP, Davis MM, Greenberg PD(1999)利用多肽- mhc四聚体从异质性人群中分离高亲和性黑色素瘤反应性CTL。免疫162:2227-2234。
13. H Yuwen H, Cox JH, Yewdell JW, Bennink JR, Moss B(1993)痘苗病毒E3L基因编码的双链rna结合蛋白的核定位。病毒学195:732 - 744。
14. Khanna R, Burrows SR, Kurilla MG, Jacob CA, Misko IS等(1992)利用重组痘苗定位eb病毒细胞毒性T细胞表位:对疫苗开发的意义。中国临床医学176:169-176。
15. 陈玲，D赞克，肖凯，吴超，邹强，等(2014)免疫显性CD4⁺健康个体中t细胞对甲型流感病毒的反应集中在基质1和核蛋白上。病毒88:11760-11773。
16. Itoh Y, Germain RN(1997)单细胞分析揭示了CD4细胞中单个细胞因子反应的分级T细胞抗原受体信号阈值和克隆内异质性⁺T细胞。中国临床医学186:757-766。
17. Gruta NLL, Turner SJ, Doherty PC(2004)急性和溶解流感病毒特异性CD8细胞因子表达谱的层次结构⁺T细胞反应:细胞因子谱与TCR活性的相关性。免疫172:5553-5560。
18. Peters T(1985)血清白蛋白。蛋白质化学37:161-245。
19. Paludan C, Schmid D, Landthaler M, Vockerodt M, Kube D，等(2005)自噬后内源性MHC II类病毒核抗原的加工。科学307:593 - 596。
20. 刘志强，刘志强，刘志强，等(2000)Epstein-Barr病毒潜伏基因的表达与功能。Mol Pathol 53: 238-247。
21. Kadri N, Potiron N, Ouary M, Jegou D, Gouin E，等人(2007)胎牛血清启动的树突状细胞在非肥胖糖尿病小鼠中诱导了强大的抗胎牛血清免疫反应和糖尿病保护作用。免疫快报108:129-136。
22. Roner S, Zinser E, Menges M, Wiethe C, Littmann L等人(2008)在多肽特异性树突细胞疫苗模型中胎儿血清旁观者耐受的次要作用:与无血清培养的比较。J免疫者31:656-664。
23. 鲍玲，郭辉，黄晓霞，黄明，等。(2009)高滴度慢病毒载体对胎牛血清特异性人类CD4 t细胞应答的影响:人类基因治疗的意义。基因Ther 16: 788-795。
24. Klenerman P, Cerundolo V, Dunbar PR(2002)用四聚体追踪T细胞:来自新工具的新故事。Nat Rev immuno2: 263-272。
25. Ogg GS, Mcmichael AJ (1998) HLA-peptide四聚体复合物。Curr Opin immuno10: 393-396。
26. Sester U, Fousse M, Dirks J, Mack U, Prasse A，等人(2011)全血流式细胞术分析抗原特异性CD4 t细胞细胞因子谱将活动性结核与非活动性结核区分开。PLoS One 6: e17813。
27. Shacklett BL, Yang O, Hausner MA, Elliott J, Hultin L，等人(2003)评估人类黏膜t细胞对HIV感染反应的方法优化。J免疫方法279:17-31。
28. Han Q, Bagheri N, Bradshaw EM, Hafler DA, Lauffenburger DA，等人(2012)人T细胞的多功能反应来自细胞因子的连续释放。中国科学院学报(自然科学版)109:1607-1612。
29. Mascher B, Schlenke P, Seyfarth M(1999)流式细胞术细胞内染色测定细胞因子表达和动力学。J免疫方法223:115-121。
30. Cebon J, Knights A, Ebert L, Jackson H, Chen W(2010)评估癌症疫苗接种者的细胞免疫应答:来自NY-ESO-1的经验教训。专家Rev疫苗9:617-629。
31. Coulie PG, Connerotte T(2005)人肿瘤特异性T淋巴细胞:功能是否比数量更重要?Curr Opin immuno17: 320-325。
32. Hartmann FJ, Babdor J, Gherardini PF, Amir ED, Jones K，等(2019)推进人体免疫治疗临床试验的全面免疫监测。Cell Rep 28: 819-831 e814。
33. Lim KP, Zainal NS(2021)监测治疗性癌症疫苗的T细胞反应。生物学报(自然科学版)8:623475。
34. Lonchay C, Van Der Bruggen P, Connerotte T, Hanagiri T, Coulie P，等人(2004)在接种MAGE抗原的黑色素瘤患者中肿瘤消退与T细胞反应的相关性。中国科学院学报(自然科学版)。
35. Lyons AB, Parish CR(1994)流式细胞术测定淋巴细胞分裂。J免疫方法171:131-137。
36. Prendecki M, Clarke C, Edwards H, Mcintyre S, Mortimer P，等(2021)免疫抑制患者对SARS-CoV-2疫苗接种的体液和t细胞反应。Ann Rheum Dis 80: 1322-1329。

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