远处肿瘤生长条件下肝脏淋巴引流方式的结构

目标的研究

实验研究在体重18-20 g、3月龄的CBA雄性小鼠上进行。动物们被喂养在标准的饮食中，并免费获得水和食物。使用动物的工作是按照“使用实验动物的工作规则”进行的。

实验中使用了两组动物。第一组包括完整的小鼠;第二组包括发生肿瘤过程的动物。肝癌-29 (G-29)细胞被用于诱导肿瘤过程。肝癌-29是由俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞学和遗传学研究所的工作人员获得和验证的，并好心地提供给我们的研究[4]。在CBA小鼠腹腔内接种G-29细胞。10天后，收集腹水，以10倍体积的生理盐水悬浮，0.1 ml注入完整动物右大腿肌肉。实验进行到第3、7、13和30天后进行材料取样研究。在乙醚麻醉下，采用颅颈脱位法取出实验动物。

肝脏标本在10%中性福尔马林溶液中固定，用标准组织学方法处理，石蜡包埋。石蜡切片用苏木精、伊红染色，并用抗体染色。免疫组化(IHC)反应的所有阶段(脱蜡、揭膜、与一抗孵育等)都按照抗体制造商的方案进行。使用LYVE-1单克隆抗体(DCSImmunoLine)和Podoplanin单克隆抗体(MONOSAN)。

亚显微镜检查，肝脏样品固定在Hanks培养基配制的4%多聚甲醛溶液中，在1% OsO中固定1小时₄溶液(四氧化锇)(Sigma，美国)在磷酸盐缓冲液(pH = 7.4)中，在不断增加浓度的乙醇中脱水，在epon (Serva，德国)中结束。在Leica EM UC7超切片机(德国/瑞士)上获得厚度为1 μm的半细切片，甲苯胺蓝染色，在LEICADME光学显微镜(德国)下研究，并使用Avigilon计算机程序拍摄。显微照片采用ImageJ计算机程序进行形态测定。肝实质和间质的体积密度，肝细胞及其核的数量密度，双核肝细胞使用140点的封闭测试系统进行估计。

厚度为70-100 nm的超薄切片与乙酸铀酰和柠檬酸铅的饱和水溶液进行对比，并在JEM 1010电子显微镜(日本)中进行检查。Disse的空间大小由ImageJ计算机程序确定。统计数据处理采用Statistica 6.0程序。计算均值和标准差，采用Mann-Whitney u检验计算差异显著性，取p<0.05。

Yu I Borodin制定了淋巴区作为一个形态功能单位的概念，其中包括运输和解毒成分。它覆盖了器官(身体的一部分)的区域淋巴器官及其淋巴疡池。在淋巴区，有3个淋巴引流环节:从细胞周间隙到淋巴床根部的间质性非血管质质转移路径、淋巴管(毛细血管、后毛细血管、血管)和区域淋巴结。肝脏的非血管微循环床相当复杂，至少由2个级联组成:Disse空间和门脉周围Mall空间[5]。

在研究实验动物大腿肌肉组织中G-29肿瘤生长动力学中的肝脏结构时，肝细胞的容重有降低的趋势。实验第30天，肿瘤生长动物肝细胞体积密度比正常动物低22% (p<0.05)(图1a)。

此时，在本研究期间，肝细胞数值密度值降低了30% (p<0.05)(图1b)，正弦空间的体积密度增加了88% (p<0.05)(图1c)。

图1:远处肿瘤生长条件下肝脏的结构组织。(a)肝细胞细胞质体积密度(Vv);(b)肝细胞数值密度(Na);(c)正弦信号体积密度(Vv)。

第3天、第7天、第13天、第30天是实验动物大腿部位肝癌发生的时间;* -与对照组差异显著性p<0.05。

Podoplanin淋巴标记物免疫组化染色，根据文献资料对肝窦内皮细胞进行染色，明确显示肿瘤生长过程中肝窦扩张，在实验第30天最明显(图2a)[4]。

在门静脉道检测到Podoplanin+淋巴管毛细血管，管腔适度扩张(图2b)。肝脏边缘肌间隙增大，窦状内皮细胞肿胀(图2c)。在远处肿瘤生长的条件下，观察到肝细胞淋巴引流最初部分的结构变化，表明肝脏中淋巴过程增加，这可能是由于与肿瘤发展相关的血液中有毒代谢物的存在。

图2::实验动物大腿区肝癌发展条件下肝脏淋巴引流通路的结构组织。
(a)实验30天后肝窦间隙增大。淋巴管内皮标记物Podoplanin免疫组化染色。增加了10x100。
(b)实验3天后门脉毛细血管的淋巴管。淋巴管内皮标记物Podoplanin免疫组化染色。增加了10x100。
(c)实验13天后，内皮窦细胞的Disse间隙扩大，胞质肿胀。增加了x20000。

在对肿瘤生长动力学中肝细胞淋巴引流的初始部分进行形态计量分析时，发现了Disse间隙大小的显著变化。试验3天后，Disse的空间大小增加了13% (P<0.0001)， 7天后，该参数值与对照组的相应值没有差异。试验第30天，Disse的空间增大了21% (P<0.0001)。实验第30天，该参数值恢复到初始值(表1)。

表1:远处肿瘤生长条件下动物肝脏Disse 's间隙的大小。

* * * P
已知正常条件下Disse的空间大小为0.2 ~ 1 μm。肝细胞和来自血窦的血浆之间的代谢发生在迪斯腔内。肝细胞与迪斯间隙接触的细胞膜形成微绒毛，使细胞表面积增加6倍。在Disse的空间中，Ito细胞是纤维形成最重要的参与者。

淋巴是在细胞外液通过鼻窦薄壁毛细血管的淋巴引流过程中形成的。由于毛细血管的通透性，代谢得以进行，组织液、蛋白质、脂肪(米库林和其他脂肪)被输送到血液[6]。

在肝癌发展的条件下，体内会形成有毒产物，这些有毒产物是由于肿瘤生长而形成的，通过血流进入肝脏。同时，肝脏作为排毒和代谢的中枢器官，最容易受到恶性生长产物的毒性作用。在这种情况下，有效的肝淋巴引流对肝细胞的正常功能极为重要。

在远处肿瘤生长的条件下，由于肝脏淋巴引流的改变，可见[7]的破坏性改变。溶酶体体积密度增加，脂包体体积密度降低，分别在第13天和第30天降低了90%和70% (p<0.05;表2)。在肿瘤发展的第3天，糖原体积密度下降67% (p<0.05)。试验第3天，线粒体体积密度下降22% (p<0.05)，第30天下降68% (p<0.05)。实验第30天，内质网池的体积密度、附着的和游离的多体核糖体的数量密度均显著降低(表2)。

表2:远处肿瘤生长条件下肝细胞的形态计量学研究结果(±英镑）.

众所周知，淋巴系统通过调节组织液的流出并将其返回静脉血来维持组织内稳态。它在膳食脂肪的吸收和运输中起着重要作用。此外，淋巴系统的血管是抗原和抗原提呈细胞从外周到淋巴结的主要导体，这对免疫监测和获得性免疫[7]至关重要。

在我们的研究中，我们注意到肝细胞在远处肿瘤生长过程中淋巴引流的动态变化。在研究的第三天，肝脏淋巴引流的初始部分- Disse 's space的尺寸显著增加，与实验动物大腿肌肉组织中肿瘤生长的积极发展有关。第二个更显著的增大是由于肿瘤过程[10]的最大发展。实验进行到第30天Disse腔的缩小，显然是由于在肿瘤过程进一步发展导致毒性负荷增加的情况下，肝脏引流系统的衰竭。

注意:Vv为结构的体积密度(占细胞质体积的%)，N_一个为结构的数值密度(测试区域内的数量)，EPR为内质网。* p与对照组相比<0.05。

肝脏中的淋巴来自血浆成分，经窦内皮细胞的开窗过滤进入Disse 's腔，然后进入间质Mall 's腔、淋巴毛细血管和门静脉道血管[4]。在我们的研究中，实验30天后，在远处肿瘤生长的条件下，观察到肝脏门静脉的淋巴毛细血管和血管管腔明显增大，表明从器官流出的淋巴管增多(图3)。