背景:23S rRNA中的许多核苷酸在转录后被甲基转移酶甲基化，并聚集在位于70S核糖体50S亚基的肽基转移酶中心(PTC)和新生肽基出口通道(NPET)周围。新生肽和隧道之间的生化相互作用可能会阻碍核糖体的运动并影响蛋白质的表达水平。然而，没有研究显示NPET在使用NPET突变体的核糖体停滞中的作用。
结果:核糖体谱分析链球菌引起的肺炎首次证明了与野生型相比，NPET突变体表现出完全不同的核糖体占用率。我们使用RNA脚印打印证明核糖体占用的变化与核糖体停滞的变化相关。此外，统计分析表明，导致核糖体停滞的短肽序列是种特异性和进化选择的。PET结构需要实现这些种特异性核糖体停滞。
结论:结果支持NPET在核糖体阻滞中的作用。NPET结构是实现物种特异性和进化保守核糖体停滞所必需的。这些发现阐明了NPET结构在翻译过程中的作用。
核糖体停滞;核糖体剖析;Ribosomopathy;23 s rRNA修改;链球菌引起的肺炎
内源性rRNA修饰酶甲基化或伪脲酸化核糖体中功能重要区域的特异性rRNA核苷酸，如肽基转移酶中心(PTC)[1]。大约三分之一的23S rRNA修饰残基聚集在新生肽出口通道(NPET)[2]周围。虽然rRNA修饰的作用尚不明确，但普遍认为它们通过新生肽和隧道之间的生化相互作用，对转译[3]的核糖体具有微调功能，特别是在应激条件[4]下[5,6]。这些相互作用可能阻碍核糖体运动，从而影响蛋白[6]的表达水平。然而，没有研究表明使用NPET突变体在核糖体停滞中的作用。
NPET的某些修饰对确定抗生素耐药性或敏感性很重要[7,8]。而甲基化作用在G748 (m1G748)链球菌引起的肺炎还不清楚，我们之前已经证明甲基转移酶RlmA的失活2甲基化位于PTC附近的核苷酸G748的N-1位置，导致erm (B)携带中对telithrmycin (TEL)的耐药性增加年代.pneumoniae[7]。
我们通过建立核糖体谱分析初步探讨了NPET结构在转译中的作用美国肺炎研究野生型和RlmA的核糖体分布2有缺陷的肺炎链球菌．随后的分析表明m1G748负责核糖体停滞和发挥种特异性的作用。
N-1甲基化在G748位点的缺失，极大地改变了核糖体的分布
我们建立两个美国肺炎突变株Sp284和Sp379，研究NPET的作用。Sp284是一个RlmA2-中断突变体，携带pTKY1111编码tlrBS1株[7]。Sp379是RlmA2-突变体pTKY1127，编码Sp44[7]的tlrB。后者因C23R突变[7]而无甲基转移酶活性。Sp284和Sp379的区别仅仅在于甲基化G748的能力。
我们还对Sp284和Sp379进行了基于深度测序的核糖体分析。核糖体分析通过单核苷酸分辨率捕获模板mrna上核糖体定位和密度的全局快照。例如，我们选择核糖体在ermBL区域[9]停顿的erm (B)操作子来检查核糖体的分布(图1A)。核糖体在Sp379 erm(B)操作子中的位置和密度与Sp284中的位置和密度完全不同(图1A)。
erm (B)操作子中两株核糖体占用率的差异使我们推测m的一般作用1G748在翻译过程中。Sp379中所有orf的核糖体密度均高于Sp284，尤其是在后者附近1通过meta基因分析评估了所有开放阅读框(orf)中核糖体位置和密度的差异(图1B)。
图1:Sp284和Sp379之间核糖体密度(RD)图谱的差异。
(A) erm中的RD (B) Sp284或Sp379中的RD。(B) Sp284和Sp379中RD的超基因谱。所有orf的RD都相对于起始位置对齐。
米1G748影响核糖体停滞
大量的核糖体保护脚印(RPFs)映射到转录组(mRNA-seq)的独特位置表明核糖体阻滞[10]。因此，观察到的全球变化暗示了m的作用1G748在核糖体中停滞。
我们首先通过构造erm(B)操作子过表达式来验证这一假设肺炎链球菌分别从Sp284和Sp379中提取菌株Sp380和Sp382，以明确Sp284和Sp379的差异(表1和表2)。然后用硫酸二甲酯提取总RNA前后对Sp380和Sp382的核糖体进行检测。
应变 |
相关的特征 |
参考源 |
链球菌引起的肺炎 |
||
S1 |
TEL耐药临床分离物 |
[7] |
Sp36 |
从8 μg/mL含tel的BHI-Y琼脂平板中分离出S1的耐tel突变体 |
[7] |
Sp274 |
ΔtlrB：：油气地质(9)在S1 |
[7] |
Sp284 |
Sp274窝藏pTKY1111 |
本研究 |
Sp379 |
Sp274窝藏pTKY1127 |
本研究 |
Sp380 |
S1窝藏pTKY1041 |
本研究 |
Sp382 |
Sp274窝藏pTKY1041 |
本研究 |
表1:细菌菌株。
质粒 |
相关的特征 |
参考源 |
pUC18 |
克隆载体 |
实验室。集合 |
pLZ12-Km2 |
穿梭载体 |
[11] |
pTKY862 |
pLZ12-Km2带抗Sp盒式广告(9) |
[12] |
pTKY1041 |
pLZ12-Km2, S1带1401 bperm(B)片段 |
[7] |
pTKY1109 |
pUC18与328 bptlrB片段 |
[7] |
pTKY1110 |
插入抗Sp卡带aad后tlrB片段中断的pUC18 (9) |
[7] |
pTKY1111 |
pLZ12-Km2, S1有1065 bptlrB片段 |
[7] |
pTKY1127 |
pLZ12-Km2, Sp44有1065 bptlrB片段 |
[7] |
表2:质粒。
图2A显示了先前[9]证实的ermBL区域的二级mRNA结构。与本报告一致的是，在提取Sp380和Sp382菌株的总RNA后，探针探测茎中的核苷酸不受化学修饰。相反，在Sp380中提取总RNA前探测这些区域没有受到保护(图2B)，但在Sp382中这些区域仍然没有受到保护(图2B)。Sp380的茎可能被破坏在活的有机体内可能是由于核糖体在ermBL区域停滞。米1G748影响这种失速。
图2:ermBL区RNA脚印检测。
(A)[9]中提示的erm(B) mRNA中ermBL区二级结构模型。ermBL区停滞核糖体a位点的氨基酸被框起。(B) ermBL区域的RNA脚印表明Sp380和Sp382之间核糖体停滞的差异。将DMS添加到细菌培养物(体内)或总rna(体外)中。反应被淬火，总RNA被纯化，并用于引物延伸试验，以检测碱基修饰。未修饰的RNA作为对照(DMS(-))。凝胶显示从碱基117到152的底漆延伸产物。计算出的p位点周围的序列和编码的氨基酸在凝胶的一侧标明。
m效应的表征1G748关于核糖体失速
核糖体停滞并不总是意味着转译的结束。在某些情况下会恢复翻译[13,14]。这种情况被称为“短暂停滞”[15]，可能有助于共翻译蛋白，在进化上是首选的[16,17]。相比之下，“强失速”似乎不会重新启动，需要救援[18,19]。我们检查了受m影响的核糖体停滞类型1通过首先定义a位点峰值(详见方法)，并统计所有cds中a位点峰值的数量(图3A和3B)。Sp284中观察到的两个种群(图3A)与之前的报告[18]一致。然而，令人惊讶的是，在Sp379中几乎没有观察到瞬时失速(图3B)，这表明m的作用1保持瞬态失速的G748。与Sp284相比，观察到强失速峰值的数量略有下降(图3A和3B)。
图3:m1G748对瞬态失速和强失速的影响。
(A,B)分别显示Sp284和Sp379中A位点密度分布的直方图。(C) Sp284和Sp379中停滞肽序列的维恩图。停滞肽序列的数量显示在括号中。交叉区域的数量反映了常见的失速肽。
延缓肽被鉴定为先前描述的[15]，以进一步检查m1G748强失速。简单地说，我们在方法中定义了强停滞，并在出口通道中收集了强停滞事件的新生肽序列。然后我们计算了8000个三肽的发生概率，并将停滞肽定义为概率高于0.9999的三肽。令人惊讶的是，Sp284和Sp379之间几乎没有出现停滞肽(图3C)，这表明两种菌株之间“强停滞”的位置是不同的。
一些已知的延迟肽，如PPP, KKK和KKR，在一些生物中是常见的，包括酿酒酵母而且大肠杆菌(20、21)。然而，Sp284和Sp379中的停滞肽不包括这些先前报道的分子[见附加文件1]，这表明核糖体停滞是种特异性的。
米1G748是实现进化保守核糖体停滞的必要条件
拖延肽在美国肺炎在以前的报告中是不同的，这使我们猜测它们是如何在蛋白质组中分布的。我们研究了停滞肽和蛋白质组之间的关系肺炎链球菌通过初步鉴定出3个氨基酸的360个过度代表和382个不足代表的例子肺炎链球菌蛋白质组先前为[15]。使用Fisher精确测试研究了在停滞肽中过度代表和不足代表的三肽的富集(图4)。从Sp379的肽集中，过度代表的肽显著富集，而在Sp284的停滞肽集中，不足代表的肽显著富集，表明在进化上不支持强停滞[见附加文件2]。m1G748可能是实现进化保守核糖体停滞所必需的。
图4:过量和过少表达的停滞肽的富集。
在甜甜圈的中心显示了停滞肽的数量。p值表示过代表性和代表性不足的分数的统计显著性。
我们用核糖体谱分析研究了NPET在翻译中的作用肺炎链球菌．发现在m处甲基的损失1G748对核糖体的分布和核糖体阻滞有显著影响(图1和图2)，强调了NPET结构的重要性，并解释了为什么rRNA修饰聚集在PTC和NPET附近。NPET使用其他NPET突变体的作用将在未来进行研究。
NPET的改变导致停滞肽组的改变(图3C)。因此，翻译不仅取决于mRNA序列，还取决于NPET的结构。仅根据mRNA序列预测核糖体停滞是很困难的。使用NPET信息是至关重要的，因为NPET的结构在细胞[22]中不一定是唯一的，一些研究试图预测核糖体占用或停滞[22,23]，开发的软件可以通过增加NPET结构的参数来提高性能。
迟滞位置的全局变化可能导致对细胞蛋白质组的全局影响。这种效应也许可以解释为什么RlmA2突变体的美国pnuemoniae临床上很少分离出[24]。m的损失1G748甲基抑制了特利霉素与出口通道[7]的结合，也可能导致的适应度下降美国肺炎在临床环境中。这一概念可能是有用的，因为破坏维持健康核糖体的靶点的抗生素不会引起耐药细菌。TEL-resistant肺炎链球菌核糖体是不健康的。
核糖体病包括由核糖体蛋白或rRNA基因或其产物参与核糖体生物发生的其他基因的结构或功能异常引起的疾病[25-27]。骨骼肌萎缩[28]，黑钻贫血[26]和Treacher Collins综合征[26]是核糖体病的例子。然而，尚无关于出口隧道诱发核糖体病的报道。本研究考察了肺炎链球菌；然而，出口隧道衍生的核糖体病可能在包括人类在内的生物体中很常见。例如，核糖体蛋白L17 (RPL17)与应激脆弱性[29]平行上调。RPL17位于出口隧道[22]的尽头附近。因此，RPL17可能是核糖体停滞的原因。这个概念，出口隧道诱导的核糖体病，可能在未来解释紊乱的机制。
我们证明了m的作用1核糖体上的G748堵塞肺炎链球菌．米1G748需要实现物种特异性和进化保守性的停滞。甲基在m处的损失1G748对核糖体分布和核糖体阻滞有很大影响，导致出口隧道诱导的核糖体病。这可能就是为什么RlmA2突变体的美国pnuemoniae很少被临床分离。这项研究首次使用NPET突变体显示了NPET的作用。这些发现阐明了NPET结构在翻译过程中的作用。
菌株，质粒和培养基
菌株和质粒分别见表1和表2。肺炎链球菌在日本临床分离到TEL敏感性降低的菌株S1 (MIC, 2μg/ml)[7]。肺炎球菌常规培养在37°c和5% CO2在空气中加入0.5%酵母提取物(BHI-Y)肉汤和BHI-Y琼脂，并添加5%的马血。大肠杆菌在L肉汤(1%巴特-色氨酸，0.5%巴特酵母提取物，0.5%氯化钠，pH 7.4)和L琼脂中生长。必要时，在培养基中添加卡那霉素(25 ~ 500μg/mL)、大光霉素(100 μg/mL)和氨苄青霉素(25 μg/mL)。
转换
采用合成能力刺激肽(CSP) 1和Iannelli和Pozzi[30]的方法进行转化肺炎链球菌S1变成一个转换胜任的状态。
RNA-Seq
S.pneumoniae培养培养到原木阶段;将2.8 mL培养物加入2.8 mL 100°C预热的RNA裂解缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaCl和8mM EDTA)中，旋动2min。将得到的裂解物加入到5.6 mL 100°C预热的酸苯酚(Sigma-Aldrich)中，旋转5分钟。离心后，使用DirectZol (zyymo Research)从水相中提取RNA。使用MICROB Express (Ambion)从总RNA中去除rRNA。得到的总mRNA (400ng作为输入)用于构建DNA文库，使用KAPA链RNA-Seq文库制备试剂盒Illumina平台(KK8400)。使用Illumina HiSeq 1500系统和单端读取对DNA文库进行测序。使用Trimmomatic v.0.39[31]对Illumina适配器序列进行预处理，然后使用HISAT2 v.2.2.1[32]对S1基因组序列[7]进行对齐。
Ribo-Seq
库按照前面所述进行了一些修改(见下面)[10]。
细胞生长和收获:肺炎链球菌培养物(2.4L)生长至对数期。用~ 100 μg/mL氯霉素预处理细胞2 min。氯霉素预处理后，立即将培养物置于冰上。细胞在8000 ×g离心15分钟，4°C成球。取下上清液后，将细胞球重悬于2.5 mL预冷重悬缓冲液[10mM MgCl]中2, 100毫米NH4Cl, 20mM Tris (pH 8.0)和1mM氯霉素]。
裂解液制备和核酸酶消化:将细胞置于冰上超声处理，4℃，12000 × g离心10分钟。裂解液等份，含25 Abs260核糖体单位(1a260= 12 μg/μL)[5]用60 U的MNase (Roche)和60 U的SUPERase消化。在(Ambion)中加入最终浓度为1mM的氯霉素，以去除未受保护的mRNA并生成脚印片段。消化反应在25°C下孵育1 h，加入EGTA至终浓度为6 mM进行淬灭。
蔗糖分馏:用7.6mL缓冲液A和缓冲液B [10mM MgCl]制备线性蔗糖梯度[5-40% (wt/vol)]2, 100毫米NH4Cl, 2mM DTT, 20mM, 0.2 mm氯霉素，Tris pH 7.8和5%或40%蔗糖]，将缓冲B装载在缓冲A上，在16PA管中，在4℃下垂直放置12小时，在4℃下水平放置2小时。
消化后的样品小心地加载到制备的梯度上，在P28S2转子中，在4℃下，124,700 × g离心8小时。人工将蔗糖梯度分为200 μL和A260记录每个分数。在Microsoft Excel中绘制吸光度值以确定核糖体足迹相关分数(RPF分数)。RPF因此被合并。
核糖体足迹准备:用SDS/热酸苯酚从RPF中纯化RNA。3ml样品首先用SDS变性至最终浓度为1% (wt/vol)和2.7mL预热酸苯酚(65°C) (Sigma-Aldrich)。混合物在65°C下旋转5分钟。离心后，水相与1体积的酸苯酚和0.9体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合。用乙醇沉淀RNA，在10 μL的10mM Tris (pH 8.0)中重悬。
在变性聚丙烯酰胺凝胶上分解核糖体脚印样本，以选择脚印片段的大小。通过加入2倍Novex tb -尿素样品缓冲液(Invitrogen)制备RNA样品用于电泳。阶梯标准使用0.05 μg/μL 10-bp DNA阶梯(Invitrogen)，在2x Novex tb -尿素样品缓冲液和10mM Tris (pH 8.0)中制备。样品在1 × TBE缓冲液中15%铽-尿素凝胶上，在200V下分解65分钟。用SYBR金核酸凝胶染色剂(从10000倍稀释到1倍TE中)染色3分钟;Invitrogen)和紫外透光可视化。使用10-bp DNA梯切出20 - 45之间的条带来识别脚印碎片。RNA使用ZR小RNA PAGE回收试剂盒(Zymo Research)按照制造商的协议进行回收，但RNA是从最终的自旋柱中洗脱的，洗脱液为15 μL的10mM Tris (pH 8.0)。使用安捷伦生物分析仪(Agilent Technologies)上的小RNA芯片对收集的RNA进行量化和表征。
脱磷酸作用:300 pmol脚印在80°C下变性2min后置于冰上。3'端用T4多核苷酸激酶(T4 PNK;NEB)加入1 × T4 PNK反应缓冲液(不含ATP)， 20 U SUPERase。In和10u T4 PNK。反应在37°C孵育1小时。然后酶在75°C热灭活10分钟。用异丙醇沉淀RNA，在10 μL的10mM Tris (pH 8.0)中重悬。
Linker-1结扎:用10mM Tris (pH 8.0)稀释，制备20 pmolof脱磷酸化RNA。在RNA样品中加入1 μg Linker-1 (5'-App CTGTAGGCACCATCAAT ddC-d')。混合物在80℃变性90 s，然后冷却到室温15分钟。RNA与Linker-1的连接使用以下反应组分:20% (wt/col) PEG, 10% DMSO, 1 × T4 Ligase反应缓冲液，20U SUPERase•In，和10u T4 Ligase 2，截断(NEB)。反应混合物在37°C孵育1 h。在反应混合物中加入2 × tb -尿素样品缓冲液。样品在200V的1 × TBE缓冲液中溶解于10%的铽-尿素凝胶上。用SYBR金核酸凝胶染色液染色3min，紫外透光观察。用10-bp DNA阶梯法切除30 - 70nt之间的条带以标记结扎产物的大小。使用ZR小RNA PAGE回收试剂盒回收结扎RNA。结扎产物用6 μL 10mM Tris (pH 8.0)从终旋柱中洗脱。
磷酸化:收集的3'结扎样品在80°C下孵育2分钟，并放置在冰上。在1 × T4 PNK反应缓冲液和20 U SUPERase的反应组合中，5'端被T4 PNK磷酸化。在10u T4 PNK和1mM ATP。反应在37°C孵育1小时。酶在75°C热灭活10分钟。用异丙醇沉淀RNA，在6 μL的10mM Tris (pH 8.0)中重悬。
Linker-2结扎:加入1 μL的100 μM Linker-2 (5'- gagtctgcgtgtgattcgggttaggtgttggggcca -3')对RNA样品进行磷酸化。混合物在65°C下变性15分钟，并置于冰上。RNA与Linker-2的连接使用如下反应组合:17.5% (wt/vol) PEG, 1 × T4连接酶反应缓冲液，20U SUPERase。In和10u T4 RNA Ligase1 (NEB)。反应混合物在37℃孵育2.5 h。加入2 × tb -尿素样品缓冲液，在200V条件下，在1 × TBE缓冲液中10% tb -尿素凝胶上分离连接的RNA。用SYBR金核酸凝胶染色液染色3min，紫外透光观察。用10-bp的DNA阶梯法切除90 - 120nt之间的条带以鉴定结扎产物。使用ZR小RNA PAGE回收试剂盒回收结扎RNA。产物用6 μL 10mM Tris (pH 8.0)从最终自旋柱中洗脱。
反转录:4.5 μL的结扎样品与1 μL 0.1 μM Linker-1-RT (5'-ATTGATGGTGCCTACAG-3')和1 μL 0.5mM dNTP混合。得到的混合物在80°C下变性2分钟，然后在冰上快速冷却。样品在室温下孵育10分钟，使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)与以下反应混合:1 ×第一链缓冲液，5mMDTT, 20 U SUPERase。In和200u上标III逆转录酶。反应混合物(10 μL)在47℃下孵育1hr。RNA产物水解，加入1mMNaOH至终浓度为0.1 mM，在95°C孵育15分钟。cDNA产物从未扩增的引物中分离到10%的铽-尿素凝胶上，在200V条件下用1 × TBE缓冲液处理。加入2 × tb -尿素缓冲液，在95°C变性5min，制备电泳样品。凝胶在SYBR金核酸凝胶染色液中染色3 min，紫外透光观察。用10-bp的DNA梯切出90 - 120nt之间的条带以鉴定逆转录产物。 DNA was recovered using the ZR small-RNA PAGE Recovery Kit. cDNA products were eluted from the final spin column with 6 μL of 10mM Tris (pH 8.0).
第二链DNA合成:以LInker-2-partial (5'- ttaggtgttgggttgggggcca -3')和Linker-1为引物，用Q5高保真聚合酶(NEB)扩增cDNA (100 pg)。扩增的PCR产物用AMPure Bead (Beackman Coulter)纯化。用10 μL 10mM Tris (pH 8.0)洗脱双链DNA。
库的准备和测序:来自Illumina (KK8500)的KAPA Hyper Prep Kits被用于构建库，对制造商的协议进行了轻微修改。制造商的方案遵循EndRepair和a -尾随步骤，即简单地将5 μL的KAPA碎片缓冲液加入45 μL的纯化双链DNA中。使用安捷伦生物分析仪(Agilent Technologies)上的高灵敏度DNA芯片对得到的DNA文库进行量化和表征。文库测序使用Illumina HiSeq 1500系统，在添加PhiX (Illumina)至最终浓度30% (vol/vol)后进行单端读取，以提高测序质量。
序列分析:通过剪切适配器序列(linker -1和linker -2)对Illumina库进行预处理，使用TrimmomaticPE v.0.39[31]为Illumina适配器，使用CutAdapt v.2.10[33]为连接器序列。使用HISAT2 v.2.2.1[32]对S1基因组序列[7]进行测序。利用S1基因特征文件[7]进行CDS区鉴定。测序数据存入DDBJ数据库，登录号为DRA011224。
核糖体密度的定义
核糖体密度(RD)按前面描述的[34]计算，除了选择24到30 nt之间的核糖体脚印值进行计算。选择这个范围是为了评估尽可能多的足迹，以提高统计能力，并排除可能不代表足迹的片段(详情请参阅附加文件3)。
Metagene分析
每个归一化RD剖面按起始cod对齐，并在每个位置取平均值，RD剖面先按其平均密度缩放，得到超基因剖面(图1B)。
核糖体的DMS修饰
硫酸二甲酯(DMS)的改性是基于先前发表的协议[7]。肺炎链球菌培养物(2.4L)生长至对数期。细胞在4℃8000 × g离心15 min后，用250 μL DMS缓冲液[10mM MgCl]洗涤重悬2， 50mM碳酸钙酸钠pH 7.0]。的修改在活的有机体内，加入DMS溶液至终浓度为50mM, 20°C孵育1hr。加入62.5 μL的冰冷停止缓冲液[1M β-巯基乙醇和1.5M乙酸钠，pH 7.0]使反应淬灭。RNA提取采用SDS/热酸酚法。将预热(100°C)的酸酚(0.9体积)加入到淬火的混合物中，旋转5分钟。离心后，使用DirectZol (zyymo Research)从水相中纯化RNA。的修改在体外，首先从细胞悬浮液中提取RNA使用相同的方法在活的有机体内．纯化总RNA后，在DMS缓冲液中加入终浓度为50mM的DMS溶液，20°C孵育1小时后淬灭。用乙醇沉淀RNA，在20 μL的10 mM Tris (pH 8.0)中重悬。
引物延伸
每个RNA的甲基化程度由Morgan等人最初描述的引物扩展来测定，[35]。简单地说，210 μg dms检测的总RNA, 400 nM浓度的含有异硫氰酸5′-连接荧光的寡核苷酸引物(5′-[FITC] gaattaatctaacgtatttatctgcgtaatca -3′)和500 μM dNTP混合，加热到95°C 1分钟，冷却到53°C退火。加入含有上标III逆转录酶的混合物，在53°C下继续反应20分钟。在70°C孵育15分钟后，加入2 × tb -尿素样品缓冲液终止反应。延伸产物在12.5% tb -尿素凝胶上分解，并使用TyphoonFLA9000成像仪(GE Healthcare)进行观察。
a -位点峰的定义
我们首先从读取的5'端偏移[(15/27)×(L)]确定每个读取对应的a位点，其中L为每次读取的长度。然后我们用标准化的a位点计数(ribo/mRNA)作为a位点峰值。
强失速的定义
由于ermBL区域的a -位点峰数约为8，故将a -位点峰高度大于8定义为强失速。这个区域是核糖体被RNA足部打印确认的地方。然而，对于a点密度的其他截止值，结果也保持稳健。
过量、不足表达肽序列的富集
超出和不足的肽序列被鉴定为先前描述的[13]，除了p-value cutoff在表达不足的肽段为0.0001，在表达过多的肽段为0.9999。
附加文件1:补充表S1
附加文件2:补充表S2
补充文件3:补充图S1
伦理批准和同意参与
不适用。
同意出版
不适用。
数据和材料的可用性
本研究中产生的所有数据都已存入DDBJ存储库(DRA011224)。
相互竞争的利益
作者声明他们没有竞争利益。
资金
本研究由日本科学促进学会资助基金资助，研究对象为16J02984
作者的贡献
ST贡献了工作的概念和总体设计、所有的实验、生物信息学分析和Ribo-Seq数据的解释以及手稿的起草。TA对Ribo-Seq实验的设计有贡献。KY对Ribo-Seq实验有贡献。TH贡献了生物信息学分析，Ribo-Seq数据的解释，手稿的起草和手稿的实质性修改。YT参与了手稿的起草。KH贡献了工作的构思和总体设计，数据的解释，以及起草和修改的稿件。作者们阅读并批准了最终稿。
鸣谢
我们感谢Tomoko Yamamoto对手稿的讨论和评论。
Sp284中的停滞肽 |
Sp379中的停滞肽 |
常见的失速肽 |
AAA |
AAR |
EYN |
AAC格式 |
AAV |
KVQ |
油气地质 |
鼎立 |
PKP |
AAE |
爱意 |
ERG |
AAI公司 |
AEK |
EKP |
雅乐 |
AFN |
KKV |
光芒四射 |
又名 |
的是 |
AAP |
的样子 |
法国燃气公司 |
AAR |
美国心理学协会 |
KAA |
AAT |
APK |
QQP |
AAV |
应用程序 |
国家安全局 |
与 |
APQ |
NWG |
鼎立 |
ARQ |
DFA |
爱意 |
加勒比海盗 |
TGK |
AEI |
ATD |
KKA |
AEK |
长沙 |
LGR |
AEQ |
ATR |
变风量空调 |
误判率 |
艾娃 |
TPA |
AGA |
CCN |
EYC |
AGP |
中国北车 |
WGD |
啊哈 |
时间 |
爱意 |
你好 |
DFA |
EPE |
AHV |
文章 |
AAV |
AIK |
DHG |
RRV |
又名 |
DHN |
APK |
爱科技 |
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表S1:失速肽的列表。
第一列和第二列分别列出了Sp284和Sp379中的延缓肽。第三列显示了菌种之间常见的延迟肽的列表。
因而prptides |
代表人数不足的肽 |
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表S2:表达过量和表达不足的肽的列表。
第一列和第二列列出了在中表达过多的肽和表达不足的肽肺炎链球菌蛋白质组组成。
图S1:分别为Sp284和Sp379中rfp长度分布的直方图。
引用:Shoji T, Takaya A, Kusuya Y, Takahashi H, Kawashima H(2021)肺炎链球菌核糖体谱揭示了23S rRNA核苷酸G748甲基化在核糖体停滞中的作用。中华基因学报(英文版)6:024。
版权:©2021 Tatsuma Shoji等人。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
