大多数研究表明，尽管大多数COVID-19患者可能会出现轻微的肝功能紊乱，但严重的肝损伤并不常见。CCl后肝纤维化完全发展48只动物诱导7周。猴肝纤维化的临床病理参数、四项指标在人肝纤维化中也有类似的变化。CCl治疗1.5个月后，所有动物均出现肝纤维化4诱导，9个月恢复期后仍存在肝纤维化，大部分动物肝纤维化分期无明显退行。肝纤维化的生物统计学分析将有助于在各种生物医学应用中利用抗纤维化疗法及其衍生物。
动物模型;创新领导力4；肝纤维化;反向
肝纤维化是大多数慢性肝病的最后常见阶段;它是由几个因素引起的，导致了一个重大的全球卫生保健负担。近几十年来，人们对肝纤维化疾病的认识迅速发展，一些研究表明这一进展可能会倒退或逆转，这为我们开发抗纤维化疗法提供了广阔的前景。猴肝纤维化的临床病理参数、四项指标在人肝纤维化中也有类似的变化。
肝纤维化被定义为肝脏对持续性损伤的异常反应，其特征是胶原细胞外基质(ECMs)的过度积累，导致纤维化过程和伤口愈合[1-3]。肝损伤后，修复过程以两种不同的路径开始[4-8]。
持续损伤导致组织或器官受损的无节制修复过程被大量的ECM和广泛病理性纤维化引起的疼痛所取代。肝纤维化的开始以一种微妙的方式伴随着肝衰竭继续，并以肝癌风险[9]结束。原位肝移植是唯一有效的治疗与死亡率和发病率相关的肝硬化或肝细胞癌(终末期肝病)[10]。肝移植的缺点是受者终身接受毒性免疫抑制，缺少器官供体，移植受者原发疾病复发。因此，需要根据医疗需要紧急进行有效的抗纤维化治疗[11,12]。
体外模型(细胞培养和人组织培养)[13-15]和体内实验动物模型是肝纤维化研究工作的两大类。体外模型可用于特定介质和细胞行为的研究，但不能清楚地回顾体内发生的事件。几十年来，动物模型一直被用于纤维化研究和验证潜在治疗方法的抗纤维化作用[16,17]。动物模型被授权用于:在开发与解决阶段的战略时间进行多次采样，对在人体研究中可能无法解决的问题进行全面研究，并在变量数量最小的限制下进行实验测试。
目前肝纤维化研究的动物模型分为以下几类:
使用啮齿动物模型，因为它可以模拟肝纤维化的发展，但老鼠和人的需要有一些差异，如:不同的标记分子识别对应的免疫细胞亚群[32]，不同的肝脏免疫细胞群的数量和比例不同，RNA表达的多样性反映了小鼠和人[33]的基本生理差异。循环中的经典单核细胞和非经典单核细胞亚群在人类(90%:10%)和小鼠(50%:50%)中呈现不同的比例。高脂肪饮食和/或CCl4诱导鼠肝纤维化被广泛研究[24,35]。非人灵长类动物模型被发现是不可替代的，因为它们的解剖结构、基因和生理特征与人类相似，而且很少有研究报道猴子的肝纤维化。酒精诱导的肝纤维化模型(3年)也在恒河猴[36]中建立。另一项为期16周的联合CCl研究4皮下给药长期饲喂高脂饮食和饮水酒精建立食蟹猴[37]肝纤维化模型。因此，为了在合理的时间框架内用单一刺激建立非酒精性肝纤维化猴子模型，CCl4通过门静脉选择性地靶向肝脏。
畜牧
食蟹猴(3-6岁，3-7公斤)由海南金港生物科技有限公司提供。所有动物均饲养在不锈钢笼子内，笼子内设有条形地板和自动浇水阀，符合美国动物福利法案所订的标准。房间湿度控制在40% - 70%，温度控制在18°C - 29°C，换气10 - 20次/小时，光照/暗12小时。每天饲喂常规或高脂肪饮食和新鲜水果。所有动物研究的方案都得到了动物护理和使用机构委员会(IACUC)(中国江苏省苏州市药明康德有限公司)的批准。
试剂和食品
分析级试剂CCl4(目录号20050521，中华人民共和国国药控股化学试剂有限公司;MKBG7718V)。盐酸氯胺酮(目录编号;中华人民共和国福建古田药业有限公司1507293
实验
动物行门静脉插管手术。简单来说，术中异氟醚气管插管麻醉动物，动物平躺，手术区一般消毒，暴露门静脉，选择远端肠系膜静脉分支。将PE导管置入门静脉。固定好导管后，用肝素帽连接导管另一端，确认导管通畅。肝素帽皮下置于肌肉层。经过20-28天的恢复期后，这些动物就可以使用了。实验选取8只恢复期门静脉置管动物。动物被注射CCl4聚乙二醇(PEG) 400 (400 mL/L)经静脉注射入门静脉。分别以0.1 mL/kg每周一次、0.1 mL/kg每周两次和0.15 mL/kg每周两次的剂量递增给药(图1)，最后一次给药后，所有动物进入恢复期。在第一次给药前和第1、2、4、6、8、12、24、46周采集血液样本，所有血液样本从外周血管中收集到含有钾(K2) EDTA的管中或在CCl前使用分离凝胶的普通管中4在指定的日子给药。血清样本在-60度或更低的温度下保存，直到分析。
图1:CCl的剂量表4在模型诱导阶段。
本实验均行肝活检及B超检查。动物用盐酸氯胺酮麻醉(10 mg/kg)，仰卧，适当消毒，用B超(Vet-M7，迈瑞)远离大血管和胆囊，然后插入自动活检枪(acec14g x 115mm, TSK，日本)采集肝脏组织。手术后，每天由有经验的技术员观察动物，直到其恢复。
样品分析
全血样本(抗凝EDTAK)2)使用自动分析仪(ADVIA 2120，西门子)进行血液参数分析。血清临床化学参数检测采用自动分析仪(日立高科技科学系统株式会社日立7180)。血清中肝纤维化层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、IV型胶原蛋白(CIV)、III型胶原蛋白n端前肽(PIIINP)四项指标在ADC CLIA 400全自动平板免疫分析分析仪(Autobio)中采用放射免疫分析法(RIA)测定。
病理检查
肝脏组织或活检标本在10%甲醛中固定，修剪，加工，石蜡包埋，切片，苏木精和伊红染色，天狼星红染色，显微镜下检查。使用Metavir[38]系统对肝纤维化进行分类:无纤维化(F0)、纤维性门静脉扩张(F1)、桥或间隔少(F2)、桥或间隔多(F3)和肝硬化(F4)(表1)。
阶段 |
组织学描述 |
0 |
没有纤维化 |
1 |
只有3区鼻窦周纤维化 |
2 |
3区+门静脉/门静脉周围纤维化 |
3. |
就像上面提到的桥性纤维化一样 |
4 |
肝硬化 |
表1:肝纤维化[1]的简单分级和分期系统。
首先，我们引入Richards方程的一种形式如下:
在哪里D（θ)为水的扩散率;K（θ)为导水性;t表示时间;θ-肝纤维化含量;x，y，z表示坐标轴。
如果肝纤维化含量低于饱和(不饱和)纤维化含量且变化不大，则取D (θ) =一个,在那里一个是一个常数。
假设非饱和导水率是用Libardi法计算的，即
其中β是常数;K0而且θ0的价值K而且θ在稳态渗透时，分别。
接下来，我们打算简化(3.1)式，换句话说，这里我们只考虑肝纤维化在垂直方向流动的情况，因此我们有
用D（θ) =一个将式(3.2)转化为式(3.3)，得到半经验Richards方程:
然后，通过使用(G’/G)展开法，我们得到了(3.4)式的精确解，但是，我们省略了(的描述G' /G)扩展的方法。
让(∂θ=θ/∂t)t(∂θ=θ/∂z)z∝= K0Exp {- βθ0}，则式(3.4)可等价地变为
使用行波变量θ（z，t) =θ(ξ)和ξ =z-wt将式(3.5)化为常微分方程θ＝θ(ξ)
为了应用(G’/G)-展开方法，我们使用Painlevé变换v e bq =，或等效为1θlnv β =，因此(3.6)式可写成
设常微分方程(3.7)的解可以用(中的多项式表示G’/G)如下:
在哪里G＝G(ξ)满足形式为二阶微分方程
在哪里G＇ξ= (dG / d),G”= (d2G / dξ2)， a, L, a， λ，µ均为实常数，待以后确定。
根据(G1/G-展开法，考虑均匀平衡
之间的vv”而且v＇v2在(3.7)式中，我们得到3n+ 1 = 2n+ 2n=1，因此(3.8)可写成
将(3.10)和(3.9)代入(3.7)，并收集(G’)/(G)相同阶数的所有项，将(3.7)的左边一起转换为(G’)/(G)中的多项式。将每个多项式的每个系数设为零，我们得到λ，µ，ω，一个0，一个1如下:
解上面的代数方程得到
在哪里一个0是任意常数。
用(3.11)，(3.10)可以写成
将式(3.9)的通解代入式(3.12)，式(3.7)的精确解为:
根据以上讨论，我们假设肝纤维化含量，PPARγ和Nrf2满足
其中ζ δ ε = - zt， δ ε是任意常数。
生物统计模型表明，只使用特定的CCl即可建立肝纤维化4，证明了假设。现阶段有多种技术可以辅助诊断肝纤维化，但除了病理结果外，没有一种指标可以诊断疾病。而上述猴子生物统计模型是探索慢性肝病防治、开发新的诊断技术和新的治疗方法的较好系统。
猴子被给药长达7周，总CCl4给药量为1.43 ~ 3.46 mL，最后一次给药后所有动物进入恢复期。第7周时平均体重(4.61±0.56 kg)下降约9%(4.20±0.48 kg)， 6月龄和12月龄时分别增加到4.82±0.42 kg和5.45±0.52 kg(图2)。
图2:本研究中动物体重的变化(n= 8)。数值表示为平均值±SEM。
肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ -谷氨酰转肽酶(GGT)浓度在CCl后显著升高4诱导后，平均峰值分别为77.6±9.37 U/L、1071±146 U/L、1482±453 U/L和151±29.3 U/L(图3)。总胆红素(TBIL)水平升高，第4周达到峰值(8.4±1.64 mol/L)。给药后总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和白蛋白/球蛋白(A/G)比分别下降11%(70.2±1.98 G /L)、25%(31.2±1.26 G /L)和41%(0.69±0.11)4(图4)。所有变化值在恢复期逐渐恢复正常。其他临床化学参数无明显变化。本实验中红细胞、白细胞、血红蛋白等血液学指标均在正常范围内。
图3:肝纤维化过程中肝酶的顺序变化(n= 8)。数值表示为平均值±SEM。
图4:活纤维化过程中其他临床病理参数的序贯变化(n= 8)。数值表示为平均值±SEM。
HA、LN和PIIINP参数在CCl后由72.8±21.6 ng/mL增加到136±32.0 ng/mL, 201±16.9ng/mL增加到299±28.8 ng/mL, 26.1±5.27 ng/mL增加到49.5±5.94 ng/mL4分别诱导。恢复期后HA和LN水平恢复正常，但第24周PIIINP值仍高于基线(图5)。第4周CIV平均值为34 ng/mL，其他CIV值均低于定量限制(15 ng/mL)。
图5:锁齿猴CCl前后肝纤维化曲线的指标4感应(n= 8)。数值表示为平均值±SEM。
肝活检标本的病理检查显示，所有动物均发现肝纤维化(图6)。肝纤维化在恢复期持续存在(表2)，不经治疗不能自然治愈。B超检查见肝脏表面不规则或结节状，边缘钝(图7)。
图6:肝组织病理改变(200x)。天狼星红染色(A)和HE染色(D)为F3，可见形成大量的桥或隔，少量着色的巨噬细胞(铁血黄素)和单核炎症细胞。图(B, E)显示F2，少量桥或隔炎性细胞。图(C, F)为正常肝脏。
动物 |
1.5个月 |
3个月 |
6个月 |
11个月 |
1 |
1 |
2 |
2 |
1 |
2 |
3. |
3. |
3. |
2 |
3. |
3. |
2 |
2 |
2 |
4 |
3. |
4 |
4 |
3. |
5 |
2 |
2 |
2 |
2 |
6 |
2 |
3. |
3. |
3. |
7 |
2 |
1 |
2 |
3. |
8 |
2 |
2 |
2 |
2 |
表2:单个动物在初始CCl后不同月的肝纤维化分期4剂量。
图7:诱导前、诱导后1.5个月、诱导后3个月、诱导后11个月的超声肝脏图像。7a)肝缘清晰，包膜光滑，肝实质回声均匀，血管结构及轨迹正常。7b)肝缘钝厚，实质回声粗化，肝体积增大，门静脉扩张。7c)实质点状回声增强，肝缘粗糙，门静脉支软化，静脉壁模糊。7d)实质回声结构强，肝缘增厚。
天冬转氨酶(AST) - 77.6±9.37 U/L丙氨酸转氨酶(ALT) - 1071±146 U/L碱性磷酸酶(ALP) - 1482±453 U/L γ -谷氨酰转肽酶(GGT) - 151±29.3 U/L总胆红素(TBIL) -(8.4±1.64 μ mol/L)总蛋白(TP) - 11%(70.2±1.98 g/L)，
白蛋白(ALB) 25%(31.2±1.26 g/L)，白蛋白/球蛋白(A/ g) 41%(0.69±0.11)
HA参数由72.8±21.6 ng/mL增加到136±32.0 ng/mL, LN - 201±16.9ng/mL增加到299±28.8 ng/mL
PIIINP - CCl后26.1±5.27 ng/mL至49.5±5.94 ng/mL4分别诱导。
纤维化的发展动力学大致可分为三个阶段:急性损伤、纤维形成起始和晚期纤维化[39]。创新领导力4被肝细胞代谢，从而产生有毒的三氯甲基(CCl3.CYP2E1是一种在静脉周围肝细胞中表达的酶。急性小叶中心区坏死引起的伤口愈合反应如下:吞噬细胞和炎症细胞的招募以清除坏死区，2。2 .纤维生成激活和ECM增加;实质细胞和非实质细胞的增殖以取代死亡细胞。当结果重复时，连续几轮的伤口愈合发生在前一回合的愈合之前，导致纤维化积累[18]。创新领导力4经门静脉给药可导致肝纤维化、溶血和肝细胞坏死，从而降低肝脏代谢和排泄胆红素的能力，导致血液中未结合胆红素的积聚。
肝纤维化评价方法可分为有创[40]和无创[40]。非侵入性方法包括血清检测、RNA表达分析和成像技术。这些方法可以重复执行，允许持续监测潜在的纤维化在活的有机体内[41]。在本研究中，平均ALT(首次扩张)在给予CCl后增加了近20倍4．ALT从肝组织释放到循环中与肝细胞损伤程度成比例。它的水平被认为是肝损伤和肝脏疾病进展最敏感的标记之一[42]。平均AST水平在CCl后增加不到3倍4归纳。谷丙转氨酶主要存在于肝脏中，临床上在肾脏、心脏和骨骼肌中可忽略不计。相反，AST存在于肝脏、心脏(心肌)、骨骼肌、肾脏、大脑和红细胞中。因此，ALT是一种比AST更特异性的肝损伤指标，AST、ALT、ALP、GGT和TBIL四种肝酶水平的升高提示肝毒性。
ALB、TP和A/G比降低。白化酶产生于肝脏;受损的肝脏不能有效合成和维持白蛋白水平，而球蛋白则在肝脏或免疫系统中产生。这可能是在CCl期间GLB没有改变的原因4归纳。AST/ALT的比值?1（AAR) had been proposed as a test of cirrhosis in human [43], while other study demonstrate that AST/ALT ratio was confounded when used in alcoholic and many other acute and chronic fatty infiltrating liver diseases [44], and not recommended for evaluating the stage of fibrosis. Among the monkeys diagnosed as liver fibrosis, the AST/ALT ratios were below 1.0 throughout the study.
肝纤维化过程主要以肝星状细胞(肝星状细胞)的细胞激活为特征，并能表达和沉积大量细胞外基质成分[45,46]。肝脏ECM成分包括I型、III型和IV型胶原蛋白、纤维连接蛋白、波动蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸和蛋白多糖在[47]晚期均高于正常水平。HA、LN、PIIINP升高，与既往研究一致[48-50]。但慢性胰腺炎中III型胶原蛋白n端前肽(PIIINP)水平升高[44]和HA水平可能在餐后或葡萄糖饮料[51]后升高，与肝纤维化无关。
理想的生物标志物是针对肝脏的，易于获得，并在所有进行诊断生物化学/血液学的实验室之间标准化，不受假阳性结果的影响，例如由于炎症，并确定[52]纤维化的阶段。目前，没有一种非侵入性标记是特异性的，能够提供关于肝脏纤维化发生和纤维化程度的准确信息。血清模型如Fibrotest [53]， Fibrometer [54]， Fibrospect [55]， Hepascore[56]被用来预测纤维化发生，但目前不能取代金标准方法肝活检[57]。
采用Metavir评分(0 ~ 4期)评估纤维化分期。我们发现门静脉周围(中心腺泡)区嗜酸性纤维质增多(H&E染色玻片)和天狼星红染色增多，这种变化通常局限于单个小叶，但也有从一个门静脉束向另一个门静脉束的延伸(桥接纤维化)，此外还有少量着色的巨噬细胞(铁血黄素)和单核炎症细胞。
然而，使用肝活检评价存在一定的局限性。首先，肝纤维化可能不均匀分布于整个肝脏，活检标本的大小不足以包含整个肝小叶，仅代表器官的一小部分。抽样误差(25%-40%)可能导致重复性差[58]。其次，这是一种侵入性手术，导致40%和0.5%的患者出现疼痛和主要并发症。第三，病理学家在对纤维化程度进行分类时，无论[60]阶段的定义多么精确，都存在着众所周知的观察差异。在我们的实验中，肝纤维化评分在不同的月份变化不大，主要取决于肝活检的样本量和采样位置，一些包括整个肝小叶在内的组织病理图像有助于判断，在部分肝小叶图像中评估纤维化评分是一个很有挑战性的问题。增加活检样本数量可以减少错误的判断，但要注意活检是一种侵入性的过程。
肝脏纤维化的检测和评估出现了许多影像学技术，如超声[61]、计算机断层扫描(CT)[62]和磁共振成像(MRI)[63]。在我们的研究中，超声B图像显示了诱导过程中明显的变化，但它只产生特异性的发现，敏感性非常有限，不能评估纤维化阶段，特别是早期和中期。CT和MRI也存在同样的问题[64,65]。综上所述，综合评估肝脏分期时，无创和有创两种方法结合比较好。
肝纤维化的逆转仍然是一个有争议的话题。当给药中和timp1特异性抗体时，CCl中的胶原含量降低4在实验性诱导的大鼠[56]胆汁淤积中发现了[53]的-诱导纤维化和纤维化的可逆性。在人类中，肝纤维化可在基础疾病成功治疗后发生自发消退。丙型肝炎引起的肝纤维化经[54]治疗后可逆转。可能需要数年时间才能实现明显的消退，时间过程取决于肝脏疾病的根本原因及其严重程度。一些实验证据表明，肝硬化可能会达到一个不可逆转的地步。使用CCl4-中毒大鼠肝纤维化模型，晚期肝硬化重塑有限，即使经过非常漫长的恢复期，肝脏仍保持肝硬化[55,66]。我们的研究表明，经过9个月的恢复期后，肝纤维化仍然存在。另一方面，使用这个模型意味着一个长期的治疗窗口。
肝纤维化是许多慢性肝病的典型结果。动物模型已经被用于研究纤维形成和评估治疗和策略的抗纤维化潜力几十年了。既往研究表明，猴子和人类的肝脏结构相似，包括肝细胞、门静脉、胆管、门静脉和肝静脉。我们的研究表明，只使用特定的CCl就可以建立肝纤维化4，证明了假设。现阶段有多种技术可以辅助诊断肝纤维化，但除了病理结果外，没有一种指标可以诊断疾病。猴子模型被发现是一个更好的系统来探索慢性肝病的预防和治疗，并开发新的诊断技术和新的治疗方法。
我们没有利益冲突需要披露，手稿已被所有具名作者阅读和批准。
基金资助:湖北省教育厅哲学社会科学研究计划项目(19Y049)、湖北工业大学博士研究生启动研究基金项目(BSQD2019054)。
引用:蒋曦，赵斌(2022)新型冠状病毒肺炎相关性肝纤维化的病理特征。J社区医学公共卫生保健9:106。
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