基因表达和蛋白质定位的拓扑结构是生命的一个重要特征，分泌蛋白的时空动态指导着更高阶的组织，包括发育和适应程序的编排。然而，非侵入性检查体内分泌蛋白命运的工具还很缺乏。在这里，我们介绍了一种基因标记策略，在活体动物分泌蛋白的分泌和表达动态的体内成像。将其应用于典型的肝源性分泌蛋白，我们证明了这种方法，结合体内光学成像，发现了肝外凝血酶原在多个新的解剖部位(包括睾丸、胎盘、大脑、肾脏、心脏和淋巴系统)和新出现的肿瘤中的表达，导致血液中大量的肿瘤源性凝血酶原具有促凝作用。来自该小鼠模型的同基因细胞系能够在体内以高分辨率和可扩展的格式解开调控机制。除了以有针对性的方式发现蛋白质的新功能之外，该模型还允许在基因表达和分泌蛋白的可用性之间的交叉交流中识别变阻器。它也是发现新的(组织特异性的)治疗漏洞的宝贵资源。
细胞合成成千上万具有不同功能的蛋白质，这些蛋白质需要在精确的时间精确的量到达特定的位置。近三分之一的人类蛋白质组通过一个运转良好的运输系统靶向分泌环境，包括内质网、溶酶体、质膜或细胞外空间[2][3-4]。几乎所有的细胞因子、激素、受体、肽酶、通道、细胞外基质成分、转运蛋白和凝血因子都是这一机制的客户。分泌蛋白在解剖和功能分隔中也具有核心作用，例如通过控制血管隔室的功能、体积和完整性[6-8]。分泌蛋白的产生和正常输送功能障碍是多种疾病的原因，包括神经退行性疾病、发育性疾病和心血管疾病以及血流系统紊乱[9-14]。
在大多数细胞中，分泌蛋白占转录组[2]的10-20%。相比之下，肝脏中约40%的转录本编码分泌蛋白，反映了这一代谢器官的特殊功能需求。肝脏合成并向血流释放大量的分泌蛋白，包括白蛋白(调节胶体渗透压的最丰富的血清蛋白，作为载体蛋白)和大多数凝血因子[15]。因此，肝脏蛋白质生产和分泌的损害导致有害的后果[16]。这包括出血障碍和静脉血栓栓塞，这是全球死亡原因[17]，证明了肝源性分泌蛋白[14]的平衡生产的重要性。调节机制已经发展，以确保分泌蛋白[18]达到所需的功能水平，并使生产适应周转和[19]需求增加的条件。这可能还涉及到迄今为止尚未确定的(自动)调节机制，让人联想到激素反馈回路。根据空间和时间的可用性，分泌蛋白也可以显示完全不同的功能特征[20-22]。在系统层面阐明这些过程为揭示潜在的调控原则和诱发疾病的机制铺平了道路。它也可以帮助识别新的治疗机会[23]。
分子成像是一个迅速兴起的领域，提供了完整活体基本生物过程的定量、非侵入性视觉表征。除了创新的新探针和显像剂[25]外，目前的无创成像应用还涉及报告基因，以监测信号转导、细胞跟踪或转基因表达等过程，利用合成生物学耦合光声成像[26]和在人类[27]中的创新应用取得了令人兴奋的进展。传统的内源性基因表达的无创成像可能比较复杂[28-29]。间接成像依赖于报告基因的表达，例如作为转录因子丰度的代理，而直接测量则需要在不损害表观、转录和转录后调控的情况下操纵内源性基因[30-32]。尽管具有重要的医学层面，但非侵入性可视化表达和蛋白质分泌动态的工具，以及在系统水平上分泌蛋白的时空分布却令人惊讶地匮乏。
在这里，我们报道了一种新的多模态报告动物，设计用于典型肝源性分泌蛋白[33]的条件无创光学成像。这是基于多色成像来解剖凝血酶原在活体动物生理环境中的表达和分泌动态。在概念验证中，包括诱导型低胚性动物的验证，我们确认报告小鼠模型忠实地再现了已知的凝血酶原表达修饰物。我们还发现肝外凝血酶原表达在各种解剖部位和新生恶性间质肿瘤中，导致血浆中大量的功能性肿瘤源性凝血酶原，具有促凝功能。因此，它记录了一种分泌蛋白的自主表达，这种蛋白如果异常表达就会变得有害。我们进一步证明，从该报告动物获得的互补同源原代细胞培养系能够在体内以高分辨率和可扩展的高通量格式反褶积调节机制。因此，它代表了揭示疾病诱发线索和新的治疗漏洞的宝贵资源。
D-Insight鼠标线的生成
靶向策略的目的是在F2基因(NCBI转录本NM_010168_2)上生成Rluc (Renilla Luciferase)-P2A-Flag-iRFP(近红外荧光蛋白)-P2A-DTR(白鹭毒素受体)- p2a - flu2cp (Firefly Luciferase)的组成型敲入(KI)。为此，在F2基因外显子14的最后一个氨基酸和翻译终止密码子之间插入了以下片段(从5 '到3 '，补充图S1):
一个帧内loxP位点(核苷酸序列:ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgc)
一个gggsggggsggggs链接肽(核苷酸序列:ggcggcggcggcggcggcggcggcggcggggggs链接肽)
theRLuc 8.6开放式阅读框(ORF)
“自分裂”肽P2A(核苷酸序列:gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgggggagagaaccctggacct)
a标记序列(核苷酸序列:gactacaaggacacgatgacaag)
gggsgggs链接肽(核苷酸序列:ggcggcggcagggcggcggcagc)
theiRFP羊痘疮
gggsgggs链接肽(核苷酸序列:ggcggcggcagggcggcggcagc)
“自分裂”肽P2A(核苷酸序列，见上文)
此DTR羊痘疮
一个帧内loxP位点(核苷酸序列:ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatat)
“自分裂”肽P2A(核苷酸序列，见上文)
的Fluc2CP羊痘疮。
在克隆靶向载体之前，所有插入序列都经过了光学密码子使用的测试和修改(在小鼠中)。测试了所有使用的链接肽对F2、RLuc 8.6、iRFP、DTR和flu2cp的二级和三级结构的潜在干扰。阳性选择标记(purromycin resistance - PuroR)被插入内含子12的FRT位点两侧。使用C57BL/6J RPCIB-731 BAC文库中的BAC克隆生成靶向载体，并转染到C57BL/6N Tac ES细胞系中。通过阳性(PuroR)和阴性(Thymidine kinase - Tk)选择分离到同源重组克隆。在flp介导的选择标记去除后，获得了KI型等位基因1。该等位基因表达一个嵌合转录本，编码F2蛋白融合loxP-Rluc ORF、P2A序列、Flag标记序列融合iRFP ORF、P2A序列、DTR-loxP融合蛋白、P2A序列和flu2cp ORF。P2A序列上预期的共翻译“切割”导致F2- loxp - rluc、Flag-iRFP和DTR-loxP融合蛋白和flu2cp蛋白在内源性F2启动子的控制下以1:1:1:1的化学量学方式共表达。
在cre介导的去除Rluc、Flag-iRFP和DTR ORFs后，获得了组成性KI等位基因2。该等位基因应该表达一种嵌合的转录本，编码F2蛋白，与loxP、P2A序列和flu2cp ORF融合。在内源性F2启动子的控制下，P2A序列上预期的共翻译切割应导致F2- loxp融合蛋白和flu2cp蛋白的共表达。剩余的重组位点位于基因组的非保守区域。
对于条件成像，杂合子D-Insight动物与Albumin-CRE (Alb-Cre)动物配对(B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-Cre) 21Mgn/J)[68]。
诱导F2-RNAi小鼠模型
对于F2的可逆缺失，通过将强力环素诱导的shRNA盒靶向转基因到ROSA26位点(Gt(ROSA)26Sor)69，生成F2基因的诱导敲除等位基因。简单地说，为此目的，将含有诱导型H1启动子(H1tetO)驱动shRNA盒以及密码子优化四环素抑制蛋白(iTetR)组成表达的遗传元件和新霉素耐药盒的重组介导盒式交换载体转染到ROSA26位点上配置RMCE对接位点的C57BL/6 ES细胞系中。重组克隆通过新霉素耐药选择分离，阳性克隆含有6种不同的靶向F2 shRNAs，通过qPCR分析预测试其在ES细胞中的敲除效力。敲除效率最高的克隆用于小鼠系的生成。所有的动物实验都得到了当地政府的批准，动物的护理也符合机构的指导方针。
原代肝细胞的分离和原代肝细胞培养
小鼠用氯胺酮(50 μg/ml, InresaArzneimittel GmbH)麻醉，开腹。随后，将100 ml预热的(37°C)原代肝细胞分离(PHI)缓冲液I (137 mMNaCl, 52 mMKCl, 10 mM HEPES, pH7.4)灌注于门静脉。成功冲洗后，50 ml PHI-buffer II (58 mMNaCl, 52 mMKCl, 1.6 mM CaCl2, 10mM HEPES, 0.05%胶原酶，pH7.6)用于肝脏消化。然后，灌注后的肝脏外植并保存在PHI-buffer III (137 mMNaCl, 52 mMKCl, 1.6 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH7.6)中。然后在无菌条件下机械分离肝脏，通过40 μM细胞过滤器(康宁)分离并离心(90 g, 3分钟不间断)。然后丢弃上清，将肝细胞重新悬浮在15毫升预热的PBS中，然后进行第二轮离心(300克，3分钟不间断)。细胞在William’s E培养基(Biochrom)中重新悬浮。用台盼蓝排除试验测定活力。肝细胞接种于明胶包被培养皿(0.2%明胶)，在37°C含5%胎牛血清、1 μM地塞米松在DMSO、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、4 μg/ml人重组胰岛素、2 mMGlutaMAX、15 mM HEPES的William’s E培养基中培养1小时，37°C /5%CO2。每2-3天更换一次培养基。 D-Insight positivity of primary hepatocytes was confirmed by luminometric analysis (see below), by FACS based on iRFP fluorescence in a BD FACS Canto (BD Bioscience) and by an AmnisImageStream Mk II flow cytometer (Luminex) and analyzed using the IDEAS software (Luminex).
mca诱导肿瘤的产生和评估
将0.1mg甲基胆蒽(MCA)混悬液(Sigma #213942)和30μL玉米油(Sigma #C8267)肌注于D-Insight动物(8-12周龄)左臀肌中，产生甲基胆蒽(MCA)诱导的肉瘤。
肿瘤细胞系的生成
在肿瘤直径达到>2cm前取出。将肿瘤在PBS中洗涤后切成多个片段，转移到含有消化培养基(RPMI, 20%胎牛血清，100单位/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，8 mg/ml胶原酶)的6孔板中，在37℃5%CO2中孵育24小时。上下移液机械分离Umor片段，经40 μm细胞滤网过滤。悬液在1000 x g离心5分钟，得到的细胞颗粒在DMEM (Biochrom)中重悬。用台盼蓝排除法测定活力。纤维肉瘤细胞接种在含有20%胎牛血清，3.7 g/l NaHCO3 4.5 g/ ld -葡萄糖的DMEM培养皿中，37℃，5%CO2。每48 h更换一次培养基。
原代成纤维细胞培养物的生成
小鼠的耳朵在PBS中清洗，并切成几个碎片。将碎片转移到含有消化培养基(RPMI, 20% FBS, 100单位/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，8 mg/ml胶原酶)的6孔板中，孵育24小时。采用上下移液机械分离耳片，经40 μm细胞滤网过滤。悬液在1000 x g离心5分钟，得到的细胞颗粒在DMEM中重悬。用台盼蓝排除法测定活力。成纤维细胞在含有20%胎牛血清、3.7 g/l NaHCO3、4.5 g/l d -葡萄糖的DMEM培养皿中培养，37℃，5%CO2。每48 h更换一次培养基。
体内成像
使用IVIS光谱活体成像系统(Perkin Elmer, Rodgau, Germany)对D-Insight小鼠进行Ke/Xy麻醉(腹腔内注射氯胺酮(Ke, 80-120 mg/kg体重)/ xylazine (Xy, 5-10 mg/kg体重)的无创体内成像，图像使用Living Image®软件包(Perkin Elmer)获取。
小鼠身体的背侧或腹侧图像，手术中小鼠的腹侧图像，同一小鼠的体外成像(通过过量应用Ke/Xy麻醉安乐死后)或死后某些器官的成像，在i.p.注射100 μl即用的腔肠嗪(RediJetCoelenterazine H生物发光基质，PerkinElmer, Rodgau, Germany) 30分钟后或i.p.注射100 μl即用的荧光素(RediJet d -荧光素生物发光基质)10分钟后进行。PerkinElmer, Rodgau, Germany)。将伪彩色发光图像(从低到高依次为蓝、绿、黄、红)叠加在灰度摄影图像上。发光的量化是通过计算平均计数作为总计数/像素数量的定义感兴趣的区域。
Luminometry化验
10万细胞或200 mg组织在100-500 μl的被动裂解缓冲液(Promega)中在室温下的轨道摇床上裂解15分钟。取50 μl裂解液(血浆或培养基样品)，在白色96孔板中加入50 μl Bright-Glo™萤光素酶测定系统(Promega)或新鲜制备的40 ng/ml在Renilla-Glo缓冲液(Promega)中测定三份。另外，20 μl样品使用使用制造商协议(Promega)的Dual-Glo荧光素酶检测系统进行检测。使用GloMax®Discover Microplate Reader (Promega)立即测量发光(RLU)。
蛋白质转运抑制剂治疗
将200000个细胞种子置于含10% FCS、100单位/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的hepatcells - williams E培养基(Gibco, 10043282)中，37℃5% CO2孵育。3 h后，在培养基中加入0-0.5 ug/ml Brefeldin A，继续孵育2天。然后进行如上所述的光度测定。
图像流
采用图像流实时成像DI肝细胞和纤维肉瘤细胞的iRFP信号。细胞经胰蛋白酶化后，用FACS缓冲液(PBS(1倍)、牛血清白蛋白(BSA, 0.5%)、胎牛血清(FBS, 0.1%)、叠氮化钠(NaN3, 0.1%)稀释至最终浓度为每500 μL 100万个细胞。B6肝细胞和纤维肉瘤细胞作为对照。在20 μL细胞悬液中加入1 μL DAPI(1:100 000稀释PBS)，加载到ImageStreamXMkII成像细胞仪上。利用DAPI 405通道产生的信号对单细胞群和活细胞进行门控。激活纤维肉瘤细胞iRFP信号:3-5 μL盐酸胆绿素(iRFP信号激活发色团，终浓度0.002%，Sigma;30891)添加到细胞中，在37°C孵育10分钟后成像。由于已知肝细胞产生足够数量的胆红素，因此在肝细胞群中没有使用额外的胆绿素来激活iRFP。对iRFP阳性信号的活细胞进行分类，并根据702/86通道信号对细胞进行门控量化。采用INSPIRE软件进行数据分析，采用图形棱镜绘制图形。
LPS-treatment
小鼠腹腔内注射1.0 ~ 1.5 mg/kg LPS (Sigma Aldrich)。3 ~ 48 h后吸入异氟醚处死小鼠，取肝脏和血浆样本。用上述光度法测定样品。
F2中存在
使用peqGOLDTriFast试剂(Peqlab)从细胞中回收的总RNA和使用RevertAid逆转录酶试剂盒(ThermoFisher Scientific)生产的cDNA，按照制造商的说明。qRT-PCR使用带有F2引物(GGTGAACCTGCCCATTGTAGA, TCCTCGCTTGGTGTCATTCA)的蓝S绿qPCR试剂盒(Biozym)和管家基因GAPDH (AGGTCGGTGTGAACGGATTTG, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA)，按照制造商说明进行。循环(95°C 2分钟;95°C 30秒;60°C 30秒;72°C 30秒，然后熔解曲线)在CFX实时检测系统(Bio-Rad)中进行，使用CFX管理软件(Bio-Rad)计算相对表达量。
F2 RNA原位杂交(FISH)
冷冻切片是由小鼠的器官和组织生成的。简单地说，小鼠通过吸入异氟醚牺牲，器官在PBS中清洗，然后放入Tissue-Tek®Cryomolds (25×20×5mm或15×10×5mm;樱花)。立即用Tissue-Tek®o.c.t化合物覆盖标本，放在干冰上冷冻，并在−80°C保存，直到切片。冷冻切片(12 μm)使用冷冻仪制作，安装在Superfrost®plus载玻片上(Thermo Fisher Scientific)，并在4℃4%甲醛(FA)中固定过夜。
使用Thermo Fisher Scientific ViewRNA ISH组织1-Plex实验观察冷冻切片中F2 mRNA的表达。简单地说，玻片在PBS中洗涤两次，并在不断增加的乙醇浓度中脱水(50%，70%，100%;每10分钟)。干燥后，用ImmEdge笔(Vector)在标本周围画一个疏水屏障。玻片在预处理液中(85-95°C)煮沸30-45s, PBS洗涤2次，0.2M HCL RT孵育10分钟。PBS冲洗后，用蛋白酶溶液(在预热PBS中稀释1/100)孵育(10分钟，RT)载玻片，然后在PBS中冲洗，在4% FA中孵育3分钟。随后，所有后续杂交和扩增步骤均在40°C的湿室中进行。
PBS洗涤2次，ddH2O洗涤1次后，用探针组工作液(用预热的探针组稀释液稀释1/30的探针组)在40℃孵育2.5-3h进行探针组杂交。杂交后，将载玻片在室温和剧烈摇动的冲洗缓冲液中洗涤2次，时间为2分钟。然后将载玻片在稀释1/100放大器稀释剂的前置放大器溶液中孵育40分钟，然后按照上述步骤进行第二步洗涤。然后在稀释1/100的放大器稀释液中孵育40分钟。第三步洗涤后，将载玻片置于稀释1/500标签探针稀释剂的标签探针- ap中孵育40分钟，然后在洗涤缓冲液中连续摇动3分钟。在样品中加入ap增强剂溶液，室温孵育5分钟。然后将载玻片与新制备的检测底物(包括半片快速红底物，重悬于2.5 ml萘酚缓冲液中)一起孵育，在40℃的湿化室中孵育30-40分钟。PBS洗涤2倍，4% FA保存5分钟。ddH2O洗涤，美木精反染10-30秒，ddH2O脱色后，在室温黑暗环境下干燥20分钟，用DAPI (Invitrogen)公司的Fluoromount-G装片，盖上盖片，再次干燥15分钟。涂指甲油封闭边缘，4℃保存，盖上铝箔。
F2活性，APTT测量，临床化学
使用ACL Top仪器和KC4™凝血分析仪测量荷瘤动物和无瘤动物的F2活性。转氨酶(GOT/GPT)的分析已在Abbott Alinity C分析仪上进行。
白喉毒素治疗
白喉毒素(DTX)的剂量在每只动物体重的0-4 ng/g范围内滴定，2 ng/g被定义为最佳剂量，用于所示实验(注射i.p)。
D-Insight纤维肉瘤细胞的表观遗传调节剂治疗
将100000个D-Insight纤维肉瘤细胞接种于含有10%胎牛血清、3.7 g/l NaHCO3、4.5 g/l d -葡萄糖的DMEM 6孔板中，37℃5% CO2孵育24小时。然后改变培养基，加入表观遗传调节剂(10 nM (+)JQ1、10 μ玛西替丁、10 μ m地西他滨、10 μMLomeguatrib、10 nMPanobinostat、10 nquisinostat、10 μM RG108或10 μM zebularine in DMSO)，孵育2 - 7天，并按上述方法进行光度测定。
所有的统计分析和图表的制作都使用Prism 9 (GraphPad软件)进行。
凝血酶是参与血液凝血和止血的关键丝氨酸蛋白酶。它在肝脏中合成为一种不活跃的72-kDa前体蛋白(凝血酶原)，并分泌到血液循环中。一旦被激活，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，这是血凝块的主要成分，并激活血小板。除了止血[34]的作用外，凝血酶还参与许多其他过程，包括胚胎发育、血管生成、伤口愈合、炎症、动脉粥样硬化和肿瘤生物学[35-36]。这反映了凝血酶对膜结合g蛋白偶联蛋白酶激活受体(PARs)[37]的广泛作用。然而，许多这些作用自然影响位于血管外腔室[34]的细胞。这质疑了凝血酶原合成仅限于肝脏[2]的主流观察结果。
在这里，我们开始生成一个多模态成像报告动物，以表征这种多效性肝源蛋白在体内的时空动态。具体来说，我们的策略旨在创建一个报告器，用于(1)识别和量化凝血酶原表达的(非)规范起源，(2)分离内源性调控机制控制下的基因表达和蛋白质分泌动态。此外，它应该具有(3)分泌蛋白的差异标记(取决于其表达和分泌的来源)，提供(4)组件来探索下游功能，并作为(5)等基因原代报告细胞系的资源，用于进一步深入研究，包括通过可扩展的体外高含量分析的调控通路。
为了生成这一多功能工具，我们采用了一种多顺子报告策略，以B6小鼠内源性凝血酶原(F2)基因位点为靶点(图1a)。我们生成了一个条件敲入等位基因，用于在框架内插入两个发光报告子Rluc8.6-535[38]和flu2cp(后者包含两个蛋白质失稳结构域，hCL1和hPEST，以改善报告子动态)，一个明亮稳定的近红外荧光蛋白(iRFP)，用于体内成像[39]，一个人白白菌毒素受体(DTR)，直接位于翻译终止密码子和3 '非翻译区上游。通过使用高效的病毒P2A共翻译“自裂”肽[40]，内源性凝血酶原和插入的报告蛋白以严格的1:1:1化学计量法共同表达为单个蛋白[41]。虽然凝血酶原通过框架内与Rluc融合标记并分泌到循环中，但Flag-iRFP、DTR和Fluc是细胞驻留的(因此“标记”表达凝血酶原的细胞)。为了探索凝血酶原和/或表达这种分泌蛋白的细胞的下游功能，选择了一个bret兼容的Rluc标签(以允许配体-受体相互作用[42]和间隔室共定位研究[43]，除了DTR用于白喉毒素(DTX)[44]靶向细胞衰竭。对于cre介导的[45]切除，在Rluc上游和DTR下游插入两个loxp位点。这使得经典(肝源性)和非经典(肝外)凝血酶原的差异标记和条件dtx介导的凝血酶原表达细胞的枯竭。
图1:D-Insight小鼠模型对凝血酶原(F2)基因表达和分泌的时空动态进行活体条件实时成像。a: F2 D-Insight模型设计示意图，携带各种标签，通过无创实时活体(3D)成像可视化F2基因表达和分泌动态(Rluc8.6 =红移Renilla luciferase Rluc8.6-535;iRFP =近红外荧光蛋白;白喉毒素受体;flu2cp =萤火虫-萤光素酶，P2A =共翻译“自裂”肽，loxP = cre介导重组序列)。b-i，体内多重F2表达标记。b，怀孕的B6动物(与杂合子雄性D-Insight动物配对后)的死后生物荧光成像(荧光素底物i.p.注射10分钟后Fluc)显示6个胚胎(每个胚胎用星号标记)中有3个D-Insight阳性。c, d - insight阳性胚胎(3周大)显示F2基因沿颅尾轴腹侧表达，e，在大脑中(开颅后的同一动物)，与B6窝对照动物d,f。g-h，成年动物背侧和腹侧肝脏表达。一、肝脏多重标记和各自发射滤波器成像的光谱。
尽管进行了广泛的基因修饰，我们还是以预期的孟德尔比率(Figuren 1b)获得了存活的报告动物。获得的Fluc信号对转基因具有特异性，在发育中的胚胎中投射到颅尾轴的腹侧(图1c,d)和大脑(图1e,f)。这与先前的报道一致，认为凝血酶原在发育中的胚胎[46]的不同位置表达，并在神经系统[47]中发挥功能。相比之下，成年动物显示出与肝脏共定位的强信号(Fluc, Rluc和iRFP)(图1g-i)，对应于成年凝血酶原在肝脏的表达(www.proteinatlas.org)。
为了验证我们的多顺子转基因引入的DTR的功能，我们接下来给报告者和B6对照动物注射DTX。意料之中的是，我们观察到注射DTX 24小时后，肝脏中的Fluc信号下降(扩展数据图1a,b)，反映了DTX介导的该器官解体。转氨酶(GOT, GPT)的显著诱导反映了这一点，反映了肝组织损伤(扩展数据图1c)。相比之下，B6动物没有携带人类DTR没有表现出诱导。
扩展数据图1:通过白喉毒素受体介导的靶向和cre介导的报告基因切除对D-Insight模型进行功能定制。a-c白喉毒素(DTX)介导的靶向报告表达细胞(DI +/-DTX)的验证，显示肝脏Fluc信号b的减少和相应的肝脏转氨酶(谷草转氨酶(GOT)，与野生型B6动物相比，DTX注射24小时后谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT))。c. d-g与肝脏特异性cre系(albre)配对后，用D-Insight动物对cre介导的Rluc-DTR报告盒的切除进行验证。这导致肝脏来源的Rluc生物发光显著减少(e, f, g)，证实了条件多重报告因子标记策略的功能(图1a)。
对于大多数应用，dtx介导的凝血酶原表达细胞的消融(主要靶向肝脏)与凝血酶原表达的小位点的功能评估不兼容。此外，我们的目标是开发一种差异标记策略，使我们能够区分肝内产生的凝血酶原和肝外部位(图1a)。为了验证cre介导的条件标记，我们将D-Insight动物与肝脏特异性cre表达系(Albumin-Cre)杂交，并分析后代的生物发光。意料之中的是，我们得到的动物中，在框架内融合到凝血酶原的Rluc不再被检测到，而Fluc表达保持完整(扩展数据图1d-g)。这种操作也会导致DTR的切除(图1a)，这使得dtx介导的选择性消融表达凝血酶原的肝外细胞成为可能。消除Rluc和DTR从而引入一个功能成分，以进一步探索肝外凝血酶原的下游特征和/或体内凝血酶原表达细胞的功能。
我们的报告旨在区分凝血酶原的表达和分泌(图1a)。因此，虽然在肝脏裂解液中可以检测到Rluc和Fluc，但在血浆中只能发现Rluc信号(图2a)。比较B6和D-Insight报告动物的血浆凝血酶活性发现几乎相同的水平(扩展数据图2a)，表明Rluc标签本身并不阻碍蛋白质运输或凝血酶功能。
图2:D-Insight报告器跟踪凝血酶原基因表达(动态变化)的性能测量。A，与未标记的凝血酶原(B6)相比，Rluc标记的凝血酶原的功能，确认D-Insight动物中(接近)完全的凝血酶活性(凝血时间)。b，组织裂解物光度测定(Fluc, y轴)与凝血酶原特异性qRT-PCR (x轴)的比较，证实D-Insight报告模型具有高灵敏度、准确性和动态范围。C，多西环素诱导的shRNA小鼠模型(F2KD)沉默凝血酶原示意图。D，强力环素介导的shRNA诱导降低肝脏中凝血酶原mRNA和蛋白质，并延长凝血时间(即降低凝血酶活性)。E, F多西环素介导的shRNA诱导降低了双杂合子报告动物(F2KDxD-Insight)凝血酶原高(肝脏)和低(脾脏、肾脏)丰富组织中凝血酶原的Fluc信号，证实了记录的Fluc报告信号的特异性。G，活性双杂合报告动物(F2KDxD-Insight)在添加和终止补充多西环素后的报告开/关动力学(Fluc)。用虚线表示的非线性回归(单相衰减)。
图2:差异标记区分了胚胎和成年动物中凝血酶原的表达和分泌动态，并确定了许多肝外来源。A，标记的凝血酶原被分泌到循环中。虽然在肝脏裂解液中可以检测到Rluc和Fluc，但只有Rluc(与凝血酶原融合，图1a)被分泌，因此可以在血浆中检测到。B，败血症D-Insight动物的表达和分泌动态(LPS注射后)显示F2基因表达(肝脏中Fluc)的早期诱导，并延缓血液循环中Rluc标记的凝血酶原(血浆中Rluc)的积累。非线性回归(Sigmoidal dose-response)用虚线表示。在胚胎c-f (c和d，怀孕B6动物与杂合子雄性d - insight动物配对后胎盘的母胎部分)和成年g-h(为简单起见，报告阴性B6对照动物的基准Fluc生物发光，平均为1-2个Fluc计数，在h中未描述;Ns =不显著)。
接下来，我们的目标是用已建立的凝血酶原表达修饰物验证该报告因子。在败血症中，凝血酶原是通过控制RNA处理[19]的调节机制诱导的。我们将脂多糖(LPS)注射到报告动物体内，观察到在LPS注射3小时后，肝脏中凝血酶原表达(Fluc强度)显著上调(图2b)——这让人想起早先报道的RNA诱导。虽然这种诱导是快速的，但血浆中凝血酶原(Rluc)的丰度在lps注射12小时后增加，但动力学缓慢(图2b)。这表明报告小鼠模型重现了已建立的凝血酶原表达动力学[19-48]。通过差异标记和定量的表达和分泌动力学，它可以在体内解开这些过程。
我们接下来测试了报告系统的准确性和敏感性，以及是否可以检测到这种原型肝源蛋白的新的解剖学起源。敲除凝血酶原对胚胎是致命的，其表型与发育过程中血管完整性受损有关[49-50]。基于此，我们希望检索与这些发现相关的凝血酶原表达特征。我们研究了凝血酶原在发育中的胚胎中的表达，并观察到胎盘的胎儿部分(和脐带)表达量显著(图2c-e)。我们还在发育中的胚胎中发现了多种其他器官的表达(图2f)。我们进一步将这些研究扩展到成年动物。我们在睾丸(图2g)和许多以前未报告的肝外部位(图2h)中发现了大量的凝血酶原表达，包括肺、胰腺、淋巴系统(脾)、肾脏和心脏。
为了进一步确认报告系统的准确性，我们比较了D-Insight动物各种组织的Fluc信号，并将其与凝血酶原RNA丰度进行比较(扩展数据图2b)。这表明，报告活性密切反映凝血酶原基因表达超过2个数量级，记录了高动态范围和灵敏度。为了控制该报告的特异性(上述背景)和开/关动力学，我们最终生成了一个以内源性凝血酶原基因为靶点的多西环素诱导短发夹(sh)RNA小鼠模型(扩展数据图2c)。在给药多西环素后，该模型(F2KD)将内源性(亲)凝血酶RNA、蛋白质和活性降低至10-25%(扩展数据图2d)。接下来，我们将该模型与报告小鼠交叉使用，并测定在给药和不给药时的发光。该分析证实了Fluc信号在凝血酶原含量高的组织(肝脏)和低含量组织(肾脏，脾脏，扩展数据图2e,f)中的特异性。此外，多西环素加入和退出时肝脏中的Fluc动力学证实了报告因子的快速启动/关闭动力学(扩展数据图2g)，这适用于动态表达改变的实时成像和由此产生的功能影响(图2b)。总之，这证明了多重成像策略的功能，以解开一个原型肝脏来源的分泌蛋白在体内的表达和分泌动力学。它还发现了凝血酶原在各种迄今未知的肝外位置的表达。
基于细胞的报告系统是阐明疾病机制和识别新的治疗漏洞[51]的有力工具。如果这样的实验装置可以在相同的基因组背景上相加进行，这将变得非常有效。为了测试原则上的适用性，我们从报告动物中生成了互补的同基因细胞系。我们使用改进的提取协议[52]分离D-Insight和B6对照动物的原代肝细胞(图3，扩展数据图3a)。初步培养后，我们使用多光谱成像流式细胞术(图3a，扩展数据图3b)、ImageStream荧光显微镜(图3b，扩展数据图3c)、光度仪和活细胞成像技术确认报告肝细胞的纯度、iRFP和Fluc阳性，其中连续稀释产生与细胞数量相关的Fluc信号(图3c)。概括在体内获得的结果(图2a)，我们还在肝细胞培养裂解物中检测到Fluc和Rluc(图3d)。相反，在培养基中，只有Rluc可以被检测到，反映了分泌的Rluc标记的凝血酶原，而Fluc仍然停留在细胞内(图3d)。此外，用蛋白转运抑制剂brefeldinA处理这些细胞会导致培养基中Rluc的显著减少(图3e)，而Rluc标记的凝血酶原有望在细胞中积累。总之，这证实了这种基于细胞的多模态报告成像方法(图1a)的功能，能够在体内以高分辨率和可扩展的格式揭示这种肝源性分泌蛋白的表达和分泌动力学的控制机制。此外，这种多模式方法为识别凝血酶原的新细胞来源提供了多种途径(例如，在脾脏和淋巴系统(图2h)或造血(骨髓)腔室(扩展数据图2b,3d,e)中识别和功能表征凝血酶原阳性细胞的流式细胞分析)。
图3:代报告细胞培养大规模鉴定表达和分泌修饰物。A，原代肝细胞分离示意图。基于B-c、FACS和ImageStream的活肝细胞iRFP阳性确认来自D-Insight报告动物和B6对照动物。d，与B6对照相比，移植d - insight骨髓(DI-BMT)的B6动物的造血凝血酶原，证实了骨髓中的Fluc阳性(扩展数据图2b) e，基于iRFP的凝血酶原表达细胞的细胞识别(和验证)示意图，在流式细胞分析(左)和富集分析(MACS或FACS分选)之后进行光度测定。在功能分析中，培养的细胞(右)作为(大规模)鉴定表达和分泌修饰物的报告模型(图3、图5和扩展数据图5)。
图3:互补同源原代D-Insight肝细胞培养模型体外探索凝血酶原表达和分泌动态。a，流式细胞术(FACS)分析和b，从D-Insight报告型和野生型B6对照动物分离的原代肝细胞的ImageStream显微流式细胞术分析，记录报告细胞系的iRFP阳性。C，培养的原代D-Insight肝细胞的活细胞成像显示细胞数量与Fluc信号之间有很强的相关性。D, Luciferase-luminometry证实，与野生型B6肝细胞相比，原代D- insight肝细胞存在特定的Fluc和Rluc信号。它还揭示了D-Insight肝细胞培养上清(培养基)中一个特定的Rluc信号，反映了Rluc标记和分泌的凝血酶原(绿色条)。e，用分泌途径抑制剂(Brefeldin A)处理D-Insight肝细胞，选择性地减少细胞培养上清(培养基)中的Rluc信号，确认了遗传标记策略的功能性和特异性。接下来，我们进行了一个概念验证实验，以探索报告小鼠模型在检测肝外凝血酶原表达的潜在新位置与致病相关性方面的表现。高达20%的癌症患者会发生静脉血栓栓塞，反映了止血系统的促凝不平衡，有显著的致命结局发生率[53-54]。因此，我们使用甲基胆蒽(MCA)肿瘤诱导模型来检测凝血酶原是否可能在新肿瘤中表达和分泌。在MCA感染的报告动物中，我们首先观察到新生肿瘤表达凝血酶原(图4a)。接下来我们将这些肿瘤移植到B6小鼠中，并获得Fluc信号，随着移植肿瘤的时间和体积的增加(图4b，扩展数据图4a,b)。 This suggests that the initial Fluc signals in the tumor unlikely originate from tumor-associated macrophages or lymphocytes frequently found in tumors[55]. To consolidate D-Insight-reporter and prothrombin expression, we analyzed tumor cell cultures obtained from these animals (Figure 4c-f). Using multispectral imaging flow cytometry and luminometry, we confirm reporter iRFP positivity (Figure 4c, Extended Data Figure 4c) and Fluc expression (Figure 4d). Using fibrosarcomas of the genetic background in which prothrombin expression can be depleted, we directly confirm endogenous prothrombin mRNA expression by F2 RNA-FISH (Figure 4e,f). Surprisingly, probing further murine and human tumors we also find extrahepatic prothrombin expression in several entities (Extended Data Figure 4d-f), suggesting that this finding may be relevant in tumor biology across species and entities[56].
图4:小鼠和人肿瘤源性凝血酶原表达。A，在B6动物移植的D-Insight肿瘤中凝血酶原表达(Fluc阳性)的增加。非线性回归(指数增长方程)用虚线表示。B，由于快速生长的肿瘤通常表现为中心坏死区域，相对Fluc信号归一化到肿瘤体积随时间下降。非线性回归(单相衰减)用虚线表示。C，基于ImageStream确认从D-Insight报告阳性纤维肉瘤中获得的存活原发肿瘤细胞iRFP阳性，与B6对照纤维肉瘤相比较。d，小鼠肝细胞癌和结直肠癌中凝血酶原阳性(d - insight动物分别接受二乙基亚硝胺治疗14个月，d - insight动物分别在西方饮食治疗6个月后以Apcmin为背景)。E，人类肿瘤的凝血酶原免疫组化和F2 RNA seq数据，显示肿瘤实体和个体内部和跨肿瘤实体和个体的不同程度的阳性(数据来自蛋白质图谱和国家癌症研究所的基因组数据公共数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov)）.
图4:具有促凝血功能的肝外凝血酶原表达新位点的鉴定。
A，在D-Insight小鼠中mca诱导纤维肉瘤，显示肿瘤相关凝血酶原表达(Fluc)。B，肿瘤相关凝血酶原表达是可移植的，并随着肿瘤体积的增加而增加。免疫活性白化无毛(AH)小鼠移植D-Insight肉瘤后，分别在第10、20和30天的Fluc无创活体生物发光成像(y轴为Fluc, x轴为肿瘤体积，n>3只动物每个时间点)。非线性回归(指数增长方程)用虚线表示。c,d, ImageStream和纤维肉瘤的光度测定证实iRFP阳性和Fluc在d - insight纤维肉瘤中表达。e,f，肿瘤固有的F2表达通过F2- rna - fish证实，伴或不伴强力霉素介导的F2缺失。G，肿瘤源性凝血酶原分泌进入血液循环。载瘤小鼠的D-Insight报告Fluc信号(x轴)(红色)反映了肿瘤细胞中凝血酶原的表达量，其与分泌到循环中的肿瘤源性凝血酶原的量呈正相关(y轴，血浆中的Rluc;B6小鼠肌肉组织和血浆中分别获得的信号(蓝色)作为非特异性背景对照)。值得注意的是，携带D-Insight肉瘤的B6小鼠(红色)表达和分泌大量的凝血酶原，达到Rluc血浆水平，与D-Insight对照小鼠的肝源性凝血酶原相当(灰色阴影走廊)。 h, Ectopically expressed prothrombin by the tumor is functionally active (assessed by KC4™ Coagulation Analyser; comparing blood plasma clotting time of F2-KD (F2), B6 mice (B6), F2-KD sarcoma bearing B6 mice and B6-sarcoma bearing F2-KD mice with (+) and without (-) administration of a doxycycline (Dox) rich diet for 3 weeks).
接下来，我们探讨了我们的模型系统是否提供了进一步的见解，证实了这一意外发现的功能维度。我们测试了肿瘤来源的凝血酶原是否分泌到血液循环中。我们将D-Insight阳性纤维肉瘤移植到B6小鼠体内，分别测定肿瘤和血浆中的Fluc和Rluc水平。令人惊讶的是，我们观察到很强的相关性(图4g)。将这些信号与无瘤D-Insight对照动物的Rluc进行比较，发现血浆中可检测到大量肿瘤源性Rluc，其浓度与无瘤报告动物相当(图4g)。这表明肿瘤来源的凝血酶原在数量上是显著的;它到达血管内腔室的程度与肝中组成合成的凝血酶原相似。
凝血酶原的生物生成涉及肝脏中翻译后γ -羧化，这是[57]完全功能活性所必需的。为了确定肿瘤源性凝血酶原的潜在功能，我们首先评估了是否所有参与维生素K循环的酶都表达了。我们确认了γ羧化酶(GGXC)、NAD(P)H醌氢化酶1 (NQOV1)、维生素K环氧化物还原酶复合体亚基1 (VKORC1)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚基1样1 (VKORC1L1)在肿瘤中的表达水平与肝脏相似(或更高)(未显示)。我们还应用了凝血酶活性测量，并分析了来自正常(B6)或凝血酶原(F2)低形态动物的血浆样本，这些动物有或没有植入表达凝血酶原的肿瘤(图4f)。为此，我们使用野生型B6和F2 KD纤维肉瘤，其中凝血酶原表达可选择性减少(图4e,f)。我们发现肿瘤源性凝血酶原在B6小鼠中具有促凝血功能(图4h，对照栏1和2)。相应地，我们还观察到肿瘤源性凝血酶原在低形态凝血酶原动物中补偿凝血酶活性低(图4h，栏3和4)，当肿瘤中的凝血酶原表达被shRNA沉默时，这种补偿就失去了(图4h，栏5-8)。这表明肿瘤源性凝血酶原具有功能活性。这也可能扰乱血浆中促凝活性和抗凝活性之间的良好平衡[58-59]，从而可能导致癌症患者经常观察到的高凝状态，最终导致包括血栓栓塞死亡在内的有害后果[53-54]。
了解组织特异性基因调控[60]是癌症及其他疾病组织定制治疗的关键[61]。基于我们的发现，以组织选择性的方式靶向表达这种分泌蛋白的治疗策略是可取的。因此，我们最终测试了这种方法的适用性，并通过培养D-Insight报告动物的原代肝细胞、纤维肉瘤肿瘤细胞和成纤维细胞(作为对照)进行了小规模化学筛选(图3,4)。在我们的筛选中使用96孔板内光度法，我们意外地发现了一种DNA甲基转移酶抑制剂(地西他碱)，它显示出一种组织依赖性的长时间和高选择性调节凝血酶原基因表达影响纤维肉瘤，而在肝脏和成纤维细胞中的表达未发生改变(图5，这表明，该分泌蛋白的表达由组织选择性调节机制控制，在从动脉粥样硬化到肿瘤生物学等各种系统和疾病机制中具有多种作用[35-36]。它还说明了该模型在分析疾病机制和发现新的治疗漏洞方面的多功能性(图5)。
图5:凝血酶原基因表达的组织特异性靶向研究。
小规模的概念验证研究说明D-Insight衍生的原代细胞培养物(肝细胞、纤维肉瘤和成纤维细胞)可用于定义组织特异性治疗漏洞。
图5:用于分泌蛋白基础和应用医学研究的综合遗传报告系统。
基于多重无创体内成像结合d - insight报告阳性靶细胞(如肝细胞)的分离和培养的补充报告模型(筛选)方法的示范代表。反向和正向药理学方法统一在同生报告器设置。在这里，通过无创成像识别内源性表达和分泌凝血酶原的细胞，以及疾病模型诱导的细胞，分离和培养。这些可以通过高通量光度测定法在体外进行筛选，此外还可以通过注射到野生型小鼠和非侵入性成像在体内进行筛选。在这些系统中得到的发现最终可以使用原始的D-Insight模型在体内验证。中间的热图是一个组织选择性靶向的例子，从一个试点的概念验证研究中获得(见扩展数据图)。
肝脏是产生分泌蛋白的主要器官。虽然蛋白质靶向是通过一个特征良好的运输系统实现的3,4，但非常规蛋白质分泌的新机制正在被发现[62-63]。由于分泌蛋白在多种疾病中的重要性[9-14]，了解系统和细胞水平上的调节机制可能有助于阐明潜在的生物学和病理生理过程，包括确定新的治疗途径[23]。
在这里，我们介绍了一个有条件的，多重成像报告小鼠模型，以解开肝脏来源的分泌蛋白原型在体内的表达和分泌动力学。我们的发现说明了该报告模型在检测和阐明这种分泌蛋白在发展和各种疾病机制背景下的过程方面的多功能性。他们还记录了一种分泌蛋白的自主表达，如果异常表达就会对人体有害。此外，我们的试点筛选表明，该报告工具集适合于发现组织特异性调节机制，可能允许定制的治疗靶向。鉴于凝血酶原在各种组织中广泛表达，本文介绍的报告模型可能会在理解和分析凝血酶原在许多血管外病理生理学中的作用方面得到广泛应用[36-64]。
生物学上，我们在这里进行的概念验证观察揭示了一种关于癌症如何导致高凝表型的新机制。凝血酶原的过表达扰乱了血浆中促凝和抗凝活性之间的良好平衡。虽然在肿瘤中观察到的高表达水平较低，但累积分泌似乎在数量上超过了已确定的嗜血栓性凝血酶原多态性F2 20210 G>A[65-66]引起的促凝作用。即使是很小的肿瘤病变也会导致癌症患者经常出现的高凝状态，最终导致包括血栓栓塞死亡在内的有害后果[53-54]。鉴于直接口服抗凝剂(DOACs)的发展，绘制病理生理学中凝血酶原的时空动态图也可能揭示迄今尚未认识到的止血系统选择性靶向治疗的优势[67-69]。
除了利用时空分辨率发现止血系统的新功能外，该报告模型还具有多功能性。它允许探索基因调控和蛋白质靶向的基本生物学原理，并确定参与基因表达和分泌蛋白可用性之间的交叉交流的变阻器。互补的同生原代细胞培养模型也能在体内以高分辨率和可扩展的高通量格式反褶积调节机制。因此，它为发现致病线索和新的治疗漏洞提供了宝贵的资源，包括通过活体无创成像验证它们，反之亦然(图5)。最终，该模型是成功的多模态成像策略的指导性例子，可以简单地适用于许多其他分泌蛋白。
JN、ST、SK、EK、LKS、LH、LE、DAS进行了实验。JN和ST对数据进行分析和编译。HC解释数据并讨论结果。SD构思并监督了这项研究，进行了实验，并在所有合作者的贡献下撰写了这篇论文。
作者想表达他们对Danckwardt实验室的现任和前任成员的感激之情。我们感谢Enrico Di Cera分享了他对凝血酶原融合结构最初概念的想法，以及AncaDragulescu-Andrasi和Andreas loing对修饰的Rluc蛋白的支持信息。Kathrin Mühlbach为她关于靶向策略的支持讨论，FriederikeHäuser为肝细胞分离的协议，Kristian Schütze, Antje Canisius和Kevin Friedemann为她提供技术支持。
这项工作得到了DFG (DA 1189/2-1)、GRK 1591、DFG优先计划SPP 1935(破译mRNP代码:转录后基因调控的RNA结合决定因素)、联邦教育和研究部(BMBF01EO1003)、HellaBühler癌症研究奖和德国临床和实验室医学学会(DGKL)的资助。
引用:Nourse J, Tokalov S, Khokhar S, Khan E, Schott LK，等(2021)活体小鼠基因表达和蛋白质分泌动态的无创成像:鉴别异位凝血酶原表达作为癌症血栓形成的驱动因素。《中国药理学杂志》5:031。
版权:©2021杰米·努尔斯等人。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
