微生物燃料电池(MFC)在垃圾倾倒发电中的应用及潜在产电细菌的鉴定

如今，由于巨大的能源需求和有限的资源，世界正面临着能源危机。不可再生能源正在极大地消耗，而可再生能源没有得到适当的利用。燃烧不可再生能源会排放大量的温室气体，如二氧化碳，这对环境造成了令人担忧的后果。迫切需要寻找替代的能源生产途径[1,2]。微生物燃料电池(mfc)是缓解这一问题的解决方案之一。MFC技术，特别是通过微生物的代谢活动氧化有机物[3,4]产生能量，似乎是具有吸引力的发电[5-7]。微生物燃料电池可能会有广泛的用途，包括作为家用发电机和为小型便携式电子设备供电，如机器人[8]，汽车[9]，太空电子[10]和自食机器人[11]。波特[12,13]在90多年前首次观察到利用微生物培养产生电能。

大多数有机化合物作为化学能的基础，它们是mfc中发电等增值产品的电子来源。醋酸盐、葡萄糖、废水和石油化合物被研究为mfc的发电基质[3,14]。介体在通过微生物的催化活性从不同的基质中产生电能中起着重要的作用。有时并不需要外部介质，因为当mfc的阳极上形成生物膜时，一些细菌能够合成其内部介质[15,16]，甚至通过直接接触将电子传递到阳极[17,18]。细菌的导电菌毛对于这些密集的生物膜的发展和更高水平的当前生产[19]是必要的。并不是所有的细菌都能直接接触生物膜[5]中的电极。细菌群落和优势种的变化取决于操作状态，如接种物、底物性质和电极材料[5,20,21]。当mfc与混合培养物一起工作时，观察到的电流产生的功率密度比纯培养物更大[6,16]。几个双室MFC系统或单室MFC系统有时串联或并联以调查性能[22]。MFC是一种可靠、清洁、可替代的发电资源，它采用可再生方法，不排放任何有毒副产品[1]。 Many rural areas of country like Bangladesh still deprived of electricity and there is no effective waste management system. People dump their wastes nearby water bodies that cause environmental pollutions.

因此，本研究的目的是开发一种利用倾倒垃圾的低成本家用发电系统，同时解决环境污染和电力危机。在本研究中，首先研究了使用mfc从倾倒垃圾中产生的电力，然后串联发电室，将单个设备产生的电力结合起来，并对负责发电的个体生物进行表征。

样品收集

从孟加拉国达卡市的三个地点用无菌瓶和无菌取样袋收集废物样本。4小时后送至国家生物技术研究所微生物生物技术研究室，置于2 ~ 4℃冰箱中进行进一步研究。

无介质双室MFC的建造与运行

MFC由两个腔(阳极和阴极)由盐桥隔开。盐桥的开口用棉花堵住，以防止阳极和阴极的溶液混合。采用锌板作阳极，铜板作阴极。这种无介质的双室mfc是在阳极室中含有垃圾样品，其中含有腐烂的有机物，水和生长介质(组成(g/L):葡萄糖3,NH₄Cl 0.5, NaHPO₄0.25, Na₂HPO₄0.25, MgCl₂0.3, CaCl₂0.005, ZnCl₂0.015, CuCl₂0.0105, MnCl₂0.015，最终pH 7.5)，比例为6:4。该培养基作为产电细菌的营养补充剂，对提高产电细菌的生长和氧化能力有一定的促进作用。阴极室中蒸馏水和0.1M磷酸盐缓冲液，与阳极室比例相同。用万用表(SUOER型号:SD 830L)测量发电量(伏特和毫安单位)^圣天到20^th与对照组相比有规律的间隔。每隔5天，从阳极槽中丢弃等量的溶液后，在阳极室中加入每升3%的葡萄糖溶液100ml。采用连续模式操作(丢弃100 mL MFC之前的溶液，并在每个室中添加等量的3%葡萄糖溶液)来维持产电细菌的氧化能力。用电万用表测量发电量(伏特和毫安单位)，用连接球观察直接照明。

无介质多腔MFC的构建与操作

通过将10个单室MFC串联成[23]串联，构建了无介质多室MFC。在这种设计中，每个腔室都包含阳极和阴极电极，每个阳极与相邻腔室的阴极串联。将第一室的阴极和最后一室的阳极相互连接，测量总发电量。用电万用表测量发电量(伏特和毫安单位)，并通过连接球观察照明。

阳极样品的采集和培养

在微生物燃料电池中，锌板作为阳极是产电细菌(EB)的来源。30天后，从MFC中无菌收集阳极板。用无菌蒸馏水冲洗阳极表面生物膜，用无菌牙签擦拭表面收集生物膜。无菌烧杯中采集液体细菌样品。样品在营养琼脂培养基中采用串联稀释技术和平板法分离纯菌落。所有培养皿置于37°C培养箱中孵育24小时。观察每个平板的菌落形态。从营养琼脂培养基中随机选取性状优良的菌落，通过裸条转移到新的营养琼脂平板上，进行无菌环纯培养。然后在37°C下孵育24小时。

剂的制备

为了证明我们分离的微生物能发电，所有的房间都经过了高压灭菌和重新连接。分离出的44株纯(阳极)细菌分别接种于无菌营养肉液中，37℃、150 rpm培养18小时，制备培养接种物。无菌营养液分别接种分离菌培养物。在孵育期后，将培养物接种在MFC的单独室中，并按2.3和2.4节所述测量发电量。

通过单一培养筛选潜在细菌

设计了单室MFC，将阳极板和阴极板同时插入一个室中，以寻找潜在的产电细菌。分离出的44株细菌纯培养物分别接种于100 ml无菌营养肉液中，37°C, 150 rpm孵育过夜。孵育后，测量每个纯培养物的OD值，并重新孵育，使细胞密度相同。然后在每个单室MFC中填充人工废水(组成(mg/L):尿素91.74,NH₄Cl 12.75，乙酸钠79.37，蛋白胨17.41,KH₂阿宝₄23.4，葡萄糖3000,FeSO₄.7H₂O 5.80，淀粉122，奶粉116.19，酵母52.24，大豆油29.02,CuCl₂．2 h₂0.536 O, MnSO₄．H₂0.108 O, ZnCl₂0.208)和纯培养悬浮液(900 mL人工废水和100 mL培养液)。个人发电能力的记录与以前一样，最多为5^th每天定时从1^圣的一天。

阳极的SEM分析

MFC放置55天，在阳极板上形成生物膜。为了进行扫描电镜分析，收集阳极板，样品在极化隆E-5100溅射镀膜机(2分钟，2.2 kV)和氩气在13 Pa使用钯靶溅射镀膜，并在孟加拉国达卡大学高级科学研究中心(CARS)的JEOL JSM 6490扫描电子显微镜(SEM)中观察。扫描电镜在20千伏电压下工作，数码捕获图像[17]。

细菌群落特征

形态学和生化表征

采用形态学特征、革兰氏筛选和15种不同类型的生化试验和基于在线软件(ABIS)的方法对潜在的产电细菌进行了鉴定。

分子鉴定

分子鉴定方法用于鉴定最有潜力的细菌种类。采用苯酚-氯仿化学裂解法提取基因组DNA。采用16S rRNA细菌通用引物27f (5'-AGAGTTTGATC CTGGCTGAG-3')和1492r (5'-GCCTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR。通过16s rDNA序列分析，对最有潜力的细菌分离株HWWA-1 C17和HWWA-1 C19进行分子鉴定。利用BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将获得的序列与保存在GenBank的16S rDNA序列进行比对，并使用ClustalW对密切相关的序列进行多重比对，以确定相似性最大的生物。利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

双室MFC发电

阳极和阴极用盐桥连接，用万用表测量发电量，从1^圣天到20^th的一天。后4^th一天，由于营养的消耗，发电量开始减少。后5^th当阳极室中加入100 mL 3%葡萄糖溶液时，发电值开始像之前一样上升，并且随着时间的推移呈相同的规律(图1)。

图1:双室MFC间隔发电趋势。

多室串联发电

在双室MFC中，产生的电能不足以照明光。通过设计多腔MFC，提高了MFC的效率。10个单室MFC串联在一起，比双室MFC具有更好的效果。结合发电，为实际应用和日常生活提供更高的能量(图2和3)。

图2:串联多室发电:(A) MFC对4v灯泡的照明，(B) MFC对1.5 V灯泡的照明，(C) MFC的万用表电压读数6^th的一天。

图3:多室MFC发电随时间的变化规律。柱状图表示以电压为单位的发电量，线图表示以毫安为单位的发电量。

确认试验结果，以确定细菌代谢产生的电能

当细菌污染废水进入阳极室时，灯被点亮。然而，当在阳极室中使用蒸压废水时，灯是不亮的，这表明发电是由于存在于污泥中的产电微生物的作用。如果没有细菌，万用表的值急剧下降(从3.31mA到0.19mA)。在加入全部44个菌株后，观察到发电的模式就像未经处理的污泥，灯光再次被照亮。

潜在产电细菌的测定

利用人工废水寻找潜在的产电细菌。用单室MFC法测定了单个分离物的发电能力。44株细菌中22株(50%)具有产电能力，其余50%无产电能力。根据实验，每种细菌的产电情况如图4所示，并对大多数潜在细菌进行了区分。

图4:个别产电细菌的产电。柱状图表示以电压为单位的发电量，线图表示以毫安为单位的发电量。

SEM分析结果

mfc的阳极是一种很好的产电细菌生物膜来源。细菌群落在阳极上形成了一层生物膜，扫描电子显微镜(SEM)可以明显地保证这一点(图5)。阳极样品的最大含量为3.0 × 10⁸Cfu / ml，最低1.16 × 10⁷cfu /毫升。

图5:扫描电子显微镜:在(A) × 3000分辨率和(B) × 10000分辨率下观察细菌生物膜。

产电细菌的鉴定

在形态学和生化试验的基础上，利用在线软件对产电细菌进行了鉴定。利用ABIS在线细菌鉴定regnum原核生物软件(http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html)对潜在的产电细菌进行鉴定。结果如表1所示。

隔离标识	最近的分类单元的	分类单元的概率	隔离标识	最近的分类单元的	分类单元的概率
ESA-1 C3	莫拉克斯氏菌属犬属	99％	HWWA-1甜	莫拉克斯氏菌属cuniculi	91％
EWWA-1 C3	肠杆菌属aerogenes	91％	HWWA-1 C21	荧光假单胞菌	90％
EWWA-1 C5	假单胞菌acidovorans	90％	HWWA-1 C23	气单胞菌属hydrophila	82％
EWWA-1 C13	大肠fergusonii	92％	HWWA-1 C24	气单胞菌属salmonicida	83%
EWWA-1碳	Burholderia caryophylli	99％	ESA-1 C7	发光细菌damselae	84%
EWWA-1 C17	气单胞菌属salmonicida	95％	ESA-1 C8	伯克mallei	88％
EWWA-2 C5	Obesumbacterium普罗透斯	86％	ESA-1 C10	Sphingomonas paucimobilis	86％
HWWA-1 C6	假单胞菌fuscovaginae	81％	EWWA-1 C1	假单胞菌刺蛾	99％
HWWA-1 C12	莫拉克斯氏菌属bovoculi	99％	EWWA-1 C15	莫拉克斯氏菌属atlantae	81％
HWWA-1 C17	芽孢杆菌siamensis	80％	EWWA-2 C1	Raoultella terrigena	８５％
HWWA-1 C19	芽孢杆菌tequilensis	82％	EWWA-2 C3	伯克mallei	88％

表1:利用在线软件进行产电细菌的生化鉴定。

大多数潜在的产电细菌的分子特征

在分子鉴定方面，选择了两种产电能力最强的产电细菌(基于伏特和mA)。在生物化学鉴定后，对这些分离株进行序列检测。PCR采用16S rRNA细菌通用引物。琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带，PCR产物用DNA测序仪进行测序。最后根据DNA序列构建系统发育树(图6)，对产电细菌进行鉴定。系统进化树分析表明，HWWA-1 C17 (Sample-1)和HWWA-1 C19 (Sample-2)与副水蛭样芽孢杆菌(Bacillus副水蛭样芽孢杆菌)SBP14和地下芽孢杆菌(Bacillus地下芽孢杆菌)关系密切COOI3B分别。

图6:用大多数潜在产电细菌的序列构建系统发育树。

在本研究中，主要关注的主题是分离和富集微生物群落，从有机废物样品中发电。MFC基本上是一个厌氧处理过程，因为细菌在电极上的一个无氧室中生长。为了发电，细菌氧化废水中的有机物，并将电子传递到阳极。只有当电子通过电极时才会产生电。质子也被创造出来以维持电荷平衡，这些质子必须能够通过盐桥迁移到对电极，这样它们才能与电子和氧结合形成水。产生的电流和阴极和阳极间的电位差，创造了MFC的基础。最大电位为0.9 V。通过串联电抗器，这种低电压被转换成更高的电压，从而能够盖住光。

电微生物学有许多很有前途的研究方向。对微生物如何向电极提供电子的理解还是相当先进的。关于电子从电极到细胞的转移，人们所知甚少。由于产生的电能与有机废物释放的电子量成正比，双室MFC产生的电能较低(最高0.40 V和0.19 mA)，而多室MFC产生的电能水平较好(最高5.78 V和5.03 mA)，废水样品的内生微生物氧化有机废物。在本研究中，潜在菌株HWWA-1 C17和HWWA-1 C19分别能够产生~0.90V和~0.50 mA，优于以往的研究[24-27]。

疑似细菌的生化特征显示，分离株分别属于肠杆菌科(54.54%)和非发酵科(10种)。优势菌属为假单胞菌属和莫拉菌属(18.18%)。其次优势菌属为弧菌属和伯克霍氏菌属(9.09%)。Escherichia(4.54%)、Enterobacter、Photobacterium、Obesumbacterium、鞘hingomonas和Raoultella也存在，不同的微生物参与了其他支持的发电[24,26]。用16s 27f和1492r引物对4种最有潜力的产电细菌进行了16s核糖体RNA基因扩增。生物化学测试对细菌种类级别的鉴定不够可靠，但有时使用常用的测试系统对常见的已知细菌种类的鉴定是可能的。我们已经做了一些生物化学测试(例如15测试)，这个数量可能不足以识别细菌的种类水平，并使用软件基础分析来了解细菌群落的属。该软件通过确保不同的百分比(例如。芽孢杆菌siamensis80%)的可能性。这就是为什么，生化预测芽孢杆菌siamensis而且芽孢杆菌tequilensis可以用with代替芽孢杆菌paralicheniformis而且芽孢杆菌subterraneus分别。这些细菌显示出从有机化合物中以电的形式获取能量的巨大潜力。如果这些潜在的微生物可以接种到废水中，它就可以在发电和废物处理方面发挥双重作用。在不久的将来，可再生能源可能是解决能源和废物管理的唯一途径。

微生物发电技术仍处于发展的初级阶段，但作为一种既能处理废水又能发电的新方法，已显示出巨大的前景。我们已经指定了产电细菌。进一步优化生长条件，阐明电子传递机制，鉴定潜在的电子传递基因，将为其合理的管理和实际应用开辟新的领域。此外，还应评价介质在发电中的作用。此外，重组DNA技术的应用为MFC的工业化应用带来了广阔的前景。在像孟加拉国这样的发展中国家，能源危机突出，废物是环境的负担，MFC技术的应用可以解决这两个问题。该技术未来实施的一个关键因素将是可行的方法开发和建立和运行系统的成本。

这项研究是在孟加拉国国家生物技术研究所在孟加拉国人民共和国政府项目下进行的。作者非常感谢当局的支持。本研究的摘要已提交给2018工业生物技术和生物加工年度大会(2018年9月17-18日)。

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