间充质干细胞治疗色素性视网膜炎:综述

说到RP，我们指的是一种遗传性视网膜疾病的异质组已知的退行性光视细胞的进展。这组病变主要影响视杆细胞，随后涉及锥体功能，从而导致早期夜盲症，并发展到周边视力限制，最后由于迟发性黄斑变性[1]导致中心视力丧失。

其病因是多种多样的，与感光细胞的细胞凋亡有关。常染色体隐性RP患者(50-60%的病例)和常染色体显性RP患者(30-40%的病例)与x连锁RP患者相比，视觉预后更好，病理进展更慢。

该疾病疑似由视觉问题引起，可通过特定检查如视野测试、全视场视网膜电图(ERG)和光学相干断层扫描(OCT)来确认。后者记录基质厚度的逐渐减少，最初发生在周围，然后影响整个视网膜基质，最终导致其萎缩。进一步的研究表明，视野灵敏度的降低与外节变薄呈线性正相关。因此，在RP中，继发于细胞损失的视网膜变薄与视力[2]损害有关。

考虑到到目前为止，该病还没有治愈的治疗方法，主要目的是减缓光感受器的凋亡。这可以通过将胚胎干细胞(ESCs)、间充质干细胞(MSCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)输送到眼睛的精确目标位置来实现。这些细胞不仅通过自我修复和多能性在组织修复中发挥关键作用，还可能具有免疫抑制功能，从而抑制促炎细胞因子[3]的释放。从骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带血、羊膜等组织来源中成功分离出间充质干细胞(MSCs)，被认为是治疗视网膜退行性疾病视网膜退化细胞再生和修复的有希望的候选者。

骨髓间充质干细胞的一些重要特性，有助于这些细胞的参与作为RP的治疗，包括细胞分泌的旁分泌因子，外泌体和线粒体转移到宿主细胞。

旁分泌神经保护因子

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分泌组包含一系列神经营养因子(NTFs)，如纤毛神经营养因子(CNTF)、BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、血小板源性生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3,4 /5 (nt - 3,4 /5)、胰岛素样生长因子1 (IGF1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、PEDF和促红细胞生成素(EPO)。骨髓间充质干细胞分泌的神经营养因子与受体细胞上的同源受体结合，促进神经细胞存活、分化、轴突生长、神经细胞附着，抑制神经细胞凋亡。NTFs激活的信号通路P13K/AKT、P13K/IAP、PLC/IP3/PKC、MAPK/ERK和JAK/STAT3对神经视网膜细胞[4]具有神经保护作用。Cui等人在体外研究中证实了其神经保护作用，将骨髓间充质干细胞与视网膜神经节细胞(RGCs)共培养可以减少过氧化氢(H₂O₂)通过神经营养因子、BDNF、CNTF的表达诱导RGCs损伤，并通过RGCs[5]降低促炎因子白细胞介素1β (IL1β)和肿瘤坏死因子α (TNFα)表达。此外，Osborne等和Johnson等发现BMSCs分泌的PDGF在体外和临床前模型中分别保护RGCs[6]。Mead等人认为BMSCs分泌的NGF、BDNF和NT-3对RGCs具有保护作用，当RGCs[7]抑制原肌凝蛋白相关激酶(TrK)和PDGF受体α (PDGFRα)时，BMSCs诱导的这种神经保护作用减弱。在视神经挤压模型中，玻璃体内移植GDNF和BDNF分泌的骨髓间充质干细胞导致RGCs数量高于对照组。同样，骨髓间充质干细胞移植后，RGCs的长期神经保护和轴突再生被观察到，这与RGC层中激活PI3/AKT信号级联和挽救RGCs的FGF2和IL1β表达增加有关。Martin等人发现，在与神经视网膜外植体[8]共培养的人骨髓间质干细胞的分泌组中，神经保护(Dll4, Crim-1, Glupican-3, Cntn1)，抗炎(转化生长因子β和IL10, 13,11,4)分子以及与抗氧化(haptoglobin)，抗凋亡(Apex1)活性相关的蛋白质和蛋白质稳态(Hsp10, Hsp60, Hsp70, Hsp20, Hsp27, Kctd10, Pyk2, clusterin)显著增加。

骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡

MSC-EVs或外泌体是分泌的，双脂层状，纳米级微囊泡，封装功能分子，如蛋白质，脂质，miRNAs，可以提供重要的治疗效果。在硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)的促进下，视网膜神经元、小胶质细胞和RGCs通过小泡介导的内吞途径内吞msc - ev。此外，MSC-EVs的内吞以剂量、温度依赖的方式发生，MSC-EVs与玻璃体体液蛋白的饱和相互作用是EVs在眼内长时间滞留的原因。Yu和同事在一个视网膜激光损伤的实验模型中发现，玻璃体内注射的msc - ev在减少损伤和凋亡方面与移植的MSCs一样有效，而且还能改善视力。此外，MSC-EVs通过下调促炎介质、细胞间粘附分子1 (ICAM1)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP1)、tnf α和VEGF-A[9]的表达来改善视网膜损伤。

间充质干细胞抑制炎症反应

眼睛防止眼内炎症的能力，以保护视觉元件不受损害，从而保持视力，被定义为眼免疫特权．这种高度复杂的现象是由血视网膜屏障(BRB)和眼部微环境对先天和适应性免疫反应的局部抑制维持的，而眼部特异性机制导致免疫抑制调节性T细胞的系统性激活。然而，病理条件如RP、老年性黄斑变性(AMD)、青光眼和糖尿病视网膜病变(DR)，其特征是除了免疫细胞浸润导致BRB破裂外，还有大量的促炎细胞因子。研究表明，玻璃体内和眶周给药骨髓间充质干细胞可显著降低视网膜微环境中的炎症细胞因子、巨噬细胞和CD4的浸润⁺T细胞[10]。

间充质干细胞调节血管生成

病理性视网膜血管生成，不同于血管生成和生理性血管生成，导致紊乱，并产生生理缺陷的血管，破坏神经组织。这些新形成的血管侵入视网膜外部和黄斑窝，在那里没有血管是人类视力必不可少的[4]。许多视网膜病理条件导致血管生成异常，导致视力的进行性丧失。

Kim等人报道，在氧诱导视网膜病变的小鼠模型中腹腔注射人胎盘羊膜来源的MSCs (AMSCs)，通过TGFβ1表达导致新生血管明显消失，当转染TGFβ1 siRNA[11]时，新生血管被阻断。Ghazaryan等报道结膜下注射骨髓间充质干细胞促进角膜创面愈合，并通过下调VEGF和基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)表达[12]显著减少新生血管形成。将小鼠ADSCs玻璃体内注入糖尿病小鼠模型后，虽然眼内VEGF和PDGF水平不受影响，但TSP1表达水平显著升高。TSP1主要由健康眼睛中的RPE、脉络膜和mÜller胶质细胞产生，通过破坏受体与CD47的联系来阻止VEGF受体2 (VEGFR2)的激活，并终止VEGF信号到AKT-内皮型一氧化氮合酶通路[14,15]。TSP1也与CD36结合，并将含有Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1)引入微血管内皮细胞中的CD36-VEGFR2复合体，进而使VEGFR2去磷酸化，抑制血管生成[16]。多项研究表明，骨髓间充质干细胞成功重建受损眼组织更多依赖于旁分泌抗炎和抗血管生成因子的释放，而不是分化为眼细胞。因此，当人骨髓间充质干细胞被玻璃体内植入氧致视网膜病变小鼠模型时，视网膜新生血管明显减少。

骨髓间充质干细胞提供线粒体

一些研究报告称，MSCs通过隧道纳米管(tnt)[17]、缝隙连接[18]和外泌体[19,20]将健康的、有功能的线粒体转移到受损细胞，使其再生[21]。大量研究表明，骨髓间充质干细胞可增强脊髓[22]、支气管上皮[23]、角膜上皮[24]、心肌细胞[25,26]和受神经毒性影响的细胞[27,28]中的损伤细胞中的线粒体生物能。当骨髓间充质干细胞在玻璃体内注射时，虽然它们不通过视网膜的内限制膜(ILM)，但捐赠的线粒体有效地渗透到视网膜的内限制膜，限制了RGC的死亡。

间充质干细胞分化为视网膜细胞

羊膜来源间充质干细胞(AMSCs)、骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)、牙髓来源间充质干细胞(DPSCs)和脐带血来源间充质干细胞(UMSCs)在体外可有效分化成各种视网膜系细胞并表达视网膜细胞相关基因。一些研究还在体外系统中测试了分化细胞的功能。然而，自体间充质干细胞移植可能是视网膜疾病细胞替代治疗的一种有前途的策略;需要进一步的临床前研究来了解体内[4]移植细胞的安全性、免疫原性和功能。

光感受器的变性通常与基因突变有关。到目前为止，在70个引起RP的基因中发现了约4500个突变。RP与Usher综合征、bardt - biedl综合征相关，也可作为非综合征性RP存在。常染色体隐性RP的发病机制是由于光转导通路相关基因如cGMP磷酸二酯酶(PDE6)的突变，以及含有修正PDE6基因的重组腺相关病毒(rAAV)在眼内的传递，导致小鼠疾病模型的疾病缓解。由于Mer受体酪氨酸激酶(MERTK)突变也在常染色体隐性RP中发挥作用，通过AAV载体进行基因替换已导致RP模型和人类患者视网膜功能的改善。常染色体显性RP的基因治疗测试包括携带核酶的rAAV，设计专门抑制缺陷视紫红质基因的mRNA。据报道，当表达正常RPGR基因的AAV8载体处理突变视网膜色素变性GTPase调节剂(RPGR)时，x -连锁RP (XLRP)有阳性结果。美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一种用于RP的体内基因疗法是Luxturna，这是一种AAV2病毒，携带RPE65基因的互补DNA (cDNA)，其双等位基因突变导致隐性RP。FDA还批准了人工视网膜移植，可使晚期RP患者恢复视力。通过CRISAP/Cas9介导的基因编辑，RP患者来源的iPSCs纠正了视紫红质(RHO)基因Pro23His变体的突变和雄性生殖细胞相关激酶(MAK)基因外显子9的纯合Alu插入，被提出用于自体视网膜细胞置换。 Correction of RPGR gene by CRISPR/Cas9 gene editing also resulted in repair of defective photoreceptors and ciliopathy in the patient iPSC-derived organoids [4].

基因疗法潜力巨大，但目前仍处于实验阶段，治疗效果有限在活的有机体内．因此，科学兴趣特别指向基于干细胞的修复治疗。后者的目的是恢复细胞密度，并通过改善细胞内/细胞外条件来保存剩余的视网膜细胞[2]。

最近，Limoli视网膜修复技术(LRRT)已被开发为目前无法治疗的视网膜疾病的潜在疗法。这种手术技术是Pelaez介入的一种变体，其中只在巩膜下空间移植眼眶自体脂肪。该技术利用gff来创造一个有利于神经增强仍在运转的视网膜的环境。LRRT中自体gf的来源是某种间充质来源的细胞类型的植入物，如脂肪基质细胞、脂肪组织基质血管部分中含有的脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)和血小板(plt)，这些血小板是从新鲜全血中通过离心[3]制备的富含plt的血浆(PRP)中获得的(图1)。

图1:通过Limoli视网膜恢复技术(LRRT)获得的脉络膜上自体移植物允许将脂肪基质细胞、脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)和血小板(plt)从富含plt的血浆(PRP)中获得靠近脉络膜。生长因子(GF)的产生，这些细胞的特征，被直接注入脉络膜流，帮助维持视网膜细胞营养。gf通过脉络膜流动，直接作用于脉络膜、Müller细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)，并改善外节段(OS)的生理功能，作用于视杆细胞和视锥细胞。

在视网膜变性动物模型中注射间充质干细胞的令人鼓舞的结果导致了几个临床试验的开始。虽然大多数试验仍在进行中(表1)，但下面讨论了一些I期试验的结果。

表1:一些第一阶段的试验。RP -色素性视网膜炎，VO -静脉闭塞，HRD -遗传性视网膜疾病，SD - Stargardt病，ON -视神经病变，OND -视神经疾病，OA -视神经萎缩，RA -视网膜萎缩，VLN -夜间视力丧失，VLP -部分视力丧失。

Weiss和Levy对17例进行性RP导致双侧视力丧失的患者进行了一项苏格兰干细胞眼科治疗研究(SCOTS)临床试验，患者采用自体骨髓间充质干细胞移植。随访6个月，17例患者中有11例(64.7%)视力改善，8例(35.3%)患者病情稳定，无视力损失。这项研究还发现，眼睛对细胞治疗的反应能力与疾病的持续时间无关。

然而，Satarian等人报道，在三名晚期RP患者体内注射自体骨髓间充质干细胞，只有两名患者的视力得到改善，而第三名患者出现了严重的进行性不良反应。患者在移植后两周出现玻璃体和视网膜前纤维化，导致3个月随访期结束时完全牵拉性视网膜脱离。

Özmert和Arslan最近报道了WJMSCs开放标签III期临床试验(NCT04224207)的结果。在本研究中，我们将WJMSCs植入32例确诊为RP的患者的腱鞘下间隙。随访6个月，BCVA平均值、视网膜外壁厚度值、mf-ERG结果明显改善，视野平均偏差值下降。作者没有观察到任何严重的眼部或全身并发症，因此，保证了其安全性[1]。Mangunsong等人在一项涉及18名RP患者的前瞻性、多中心、随机临床研究(NCT04315025)中测试了UMSCs球周灌注的安全性和有效性。治疗一周后观察到光知觉和视力的改善，期间未见严重副作用[29]。

LRRT细胞治疗已被证明在与残余细胞相互作用后对某些功能参数有显著影响。自体移植物与脉络膜的直接接触增强了间充质细胞产生的生物活性因子进入脉络膜流的分泌，因此促进了其通过视网膜组织的广泛播散，最终在玻璃体[2]中渗出。

为了提高基于干细胞/祖细胞的移植治疗的安全性和有效性，需要解决以下几个尚未解决的问题和相应的策略:

总之，随着研究的深入，基于干细胞/祖细胞的移植将成为临床必不可少的治疗方法，通过医生和研究人员的共同努力，将为RD患者带来新的希望[33]。