环孢素a治疗高IgE综合征的长期缓解:临床和免疫学相关性

高IgE (HIE)综合征是一种罕见而复杂的疾病，以高血清IgE、慢性湿疹样皮炎、复发性肺感染和皮肤脓肿[1]为特征。确切的发病率尚不清楚，估计发病率在50万分之一至10万分之一之间。它在男性和女性、白种人、亚洲人和非洲人中均有发现[2,3]。85例患者报告的临床特征如下:皮肤脓肿74%，湿疹58%，保留乳牙41%，骨折39%，脊柱侧弯34%，癌症7%。近年来的研究表明，HIE患者的外周血单个核细胞(PBMCS)产生过多的IgE在体外,自发地[5]。此外，有证据表明重组白细胞介素-4 (IL-4)诱导未分化的外周血单个核细胞(PBMC)产生IgE, IL-2、IL-5和IL-6增强IgE, IFN-α、IFN-γ和PGE抑制IgE生成₂[6]。然而，IgE和淋巴因子分泌增加与HIE综合征[7]的临床病程之间没有直接的因果关系。这使得该综合征中复发感染、血清IgE水平升高和湿疹样皮炎的病因和发病机制尚不清楚。然而，最近的研究表明，常染色体显性遗传和相关疾病是由于Janus激活的激酶信号转换器和转录激活器(JAK-STAT)信号通路的缺陷，该信号通路由细胞因子如IL-6和IL-2[8]激活。

对HIE患者的治疗是令人沮丧的，在很大程度上仍然不成功。已经尝试了几种治疗方法，但取得了有限的、通常是暂时的成功[9-15]。由于HIE患者体内IgE和IL-4分泌过多，故可通过下调IgE和IL-4达到临床改善的目的。因此，我们进行了一项前瞻性的临床免疫学研究，以评估小剂量环孢素- a (CSA)对临床病程的影响，特别是HIE综合征中的皮炎和皮肤感染。3例HIE综合征患者在每天给予小剂量CSA 2-4 mg/kg治疗后，临床表现显著改善。治疗后血清IgE、IL-4、IFN-γ水平较治疗前明显下降，免疫球蛋白水平不受影响。我们的研究表明，临床表现，特别是皮炎，可能与高水平的IL-4和IgE水平有关，可通过CSA调节。但这些患者在Th17和ifn - γ等细胞因子的产生方面存在许多遗传缺陷，这些细胞因子会损害中性粒细胞，趋化性和ifn - γ注射会降低皮肤和肺部感染的频率[3,16]。在这些患者中观察到一些免疫和病理异常，包括免疫缺陷标志物，如IgD水平升高，IgG亚类减少，对蛋白质和多糖免疫反应不良[16,17]。其中38%的患者出现食物过敏症状，8%的患者出现过敏症状。 These complex immunopathological abnormalities make management of these patients difficult.

根据Buckley和Becker定义的标准，随机选择3名被诊断为HIE综合征的儿童进行研究。有两名女性和一名男性;其中一对是兄妹。在参与研究时，他们的年龄在10个月到3岁之间。所有患者在出生后的最初几周都有广泛的皮炎和反复发作的皮肤和肺部葡萄球菌脓肿、鼻窦炎和慢性耳引流的病史，他们未能生长发育。他们的血清IgE水平至少是正常年龄的10倍。

为了评估皮炎的严重程度和环孢素a治疗前后的炎症程度，采用了0-4的评分系统。0 =无皮炎或炎症，1 =皮肤小面积无感染的轻度皮炎，2 =小于50%皮肤的轻度皮炎，但无感染，3 =广泛性皮炎，累及大部分或全部皮肤，但无感染或脓肿形成，4 =与3相同，但合并感染和/或脓肿形成。

所有患者在入院时和研究期间均进行了全血计数和差异、肝和肾轮廓、体表和病变培养、胸部和鼻窦x线检查。

患者在必要时接受适当的抗生素治疗，抗组胺剂控制瘙痒，局部使用类固醇，有时全身使用类固醇控制皮肤炎症。上述措施无效后，患者开始口服环孢素- a，每日2-4 mg/kg，分两剂服用。监测血清CSA水平，使其维持在60 ~ 200 μg/ml之间。

ELISA试剂盒(Pharmacia, Uppsala, Sweden)采用Phadezym IgE PRIST检测血清IgE。用ACA离散临床分析仪(Dupont, Wilmington, DE, USA)测定IgG, IgM和IgA。

在CSA治疗前后进行了以下免疫学研究，即:
使用流式细胞分析(FACS)进行免疫表型分析
PBMC对植物血凝素(PHA)、商鼠草丝裂素(PWM)和细胞因子IL-2的有丝分裂反应
•自然杀伤(NK)细胞功能
•IL-α、IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-4的细胞因子水平

将患者和正常健康青年的全外周血收集到肝素化管中。通过ficoll - hypaqugradient分馏[19]分离PBMCs。分离的PBMC用培养基rmi -1640洗涤两次，最后悬浮到rmi -1640的完全培养基中，添加Hepes 25 mM, l -谷氨酰胺25 mM, 5%人AB血清，青霉素(100 U/ml)，链霉素(100 μg/ml)和真菌区(20 μg/ml) (Flow Laboratories, McLean, VA, USA)。台盼蓝染料(0.02%)排除法测定细胞计数和细胞活力。活性≥98%的PBMC被用于实验。

10⁵将正常人和高IgE (HIE)综合征患者的PBMC在96孔圆底微量滴度板中培养四份，最终体积为250 μl含5 μg/10的完全RPMI-1640⁶每毫升PHA或PWM (Flow Lab, McLean, VA, USA)持续72小时。增殖反应由[^3.H)胸苷(^3.在18小时脉冲后摄取HTdR。

(1 μCi/孔sp活性6.7 μCi/mM)由细胞收获器(Titretek Flow Labs, Rockville, MD)[20]收获的培养物β计数给出。

如前所述，10⁵来自正常人或高IgE患者的PBMC在100 U重组IL-2 (Genzyme, Boston, MA, USA)存在下培养72小时。增生性反应,^3.然后测量HTdR的摄取[21]。

这是使用标准的4小时51 Cr释放试验，如前所述[22]。用铬酸钠标记K562红白血病(NK敏感)细胞，以不同的12:5:1 ~ 100:1效应细胞(效应细胞:靶细胞)作为靶细胞。

特异性细胞毒性百分比计算如下:

如前所述，白细胞介素-1α (IL-1α)、白细胞介素-2 (IL-2)、干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白细胞介素-4 (IL-4)从HIE患者和正常人的血浆样本中测定，使用的是来自美国Endogen MA (IL-α， TNF-α)、美国Genzyme MA (IL-2)、荷兰生物技术(IFN-γ)和美国R&D System MN (IL-4)的高灵敏度ELISA试剂盒。在进行这些细胞因子[23]的测量时遵循了制造商的指南。

肝素化血使用荧光藻氰酸酯偶联单克隆抗体(FITC/PE-MOAbs Becton-Dickinson CA, USA)量化不同人群和淋巴细胞亚群。细胞用FITC或PE-MOAbs Leu标记⁴/ 12,亮氨酸^3./ 2,低浓缩铀⁴/博士,亮氨酸⁷/ 2,低浓缩铀^3./ 8,亮氨酸⁴4℃/11+19孵育30分钟，溶解红细胞，将细胞固定于含1%多聚甲醛的PBS中。使用FAC扫描(Becton-Dickinson CA, USA)[22]分析各种表面标记的阳性细胞百分比。

结果以均数±SE表示，各实验组间差异显著性采用单因素方差分析和学生t检验。P值≤0.05为显著性。

3例患者均符合HIE诊断标准。在确诊时和开始CSA治疗前，他们的血清IgE水平在5400 ~ 38400(正常3.84 ~ 72 μg/L)之间。所有患者都需要反复住院治疗感染和/或皮肤脓肿的手术引流。1例患者发生角膜结膜炎，因假单胞菌感染而失去一只眼。另外2例为粘膜皮肤念珠菌病。他们还患有慢性鼻窦炎和支气管扩张。金黄色葡萄球菌从所有病变中培养。外周血计数显示明显嗜酸性粒细胞增多(23-65%)。特异性IgE抗体测定在体外在牛奶、鸡蛋和小麦中，RAST得分为3-4。所有患者均未出现呼吸道过敏，但有一名患者在肺部感染期间出现喘息发作。

1、2号患者为兄弟姐妹，家族史均为阴性。3号患者有6岁的表姐，病逝时有相同的病史。我们所有患者(其他6例未报告)的父母均为近亲婚姻，通常为一等堂兄妹(图1)。

图1:3例高IgE综合征患者在环孢素- a治疗开始和治疗期间的高IgE水平。

入院时，所有患者皮肤评分均为4分。抗组胺药、皮肤润肤剂、类固醇和重复疗程的抗生素反应甚微或不明显。在开始CSA治疗的72小时内，症状有了显著的改善。大部分皮肤上的炎症都消失了;在开始CSA后的3 - 7天内，皮肤评分降至1-2。这种改善是持续的，并在整个治疗过程中持续。在开始治疗CSA患者1和2 24个月后，16个月后，患者3继续恢复良好，有轻微呼吸道感染。这种改善与血清IgE水平的急剧和显著下降相一致。除1号患者治疗后血清IgG、IgA和IgM水平由3 g升高至28 g /L外，其余患者血清IgG、IgA和IgM均未受影响。1号患者血清IgE在2周内由24000 μg降至800 μg/L, 2号患者血清IgE在7周内由38400 μg降至864 μg/L, 3号患者血清IgE在10周内由5040 μg降至480 μg/L。 Although serum IgE levels stayed above the normal range, none of the patients had levels near the pre-treatment values (Table 1).

与对照组相比，高IgE患者的PBMC对PHA和PWM的反应减弱，PHA抑制(3-37%)，PWM抑制(4-43%)。当高IgE患者的PBMC与白细胞介素-2共培养时，也发现了类似的抑制(8%-22%)(表2)。

病人		PHAa	PWMa	IL-2b
1	预处理	42453±2363	28112±1983	49008±3097
	后处理	63017±2311	50307±4763	60946±1781
2	预处理	54583±1932	43895±1108	54034±3781
	后处理	64961±1851	46388±3192	59689±1673
3.	预处理	55257±2117	47348±3013	54034±1907
	后处理	59387±3201	46407±2011	59921±2307
	正常的控制(n = 10)	67387±3217	49321±2703	62831±3781

表2:HIE患者PBL对有丝分裂原或细胞因子的增殖反应[3HTdR CPM摄取]。

与正常的PBMC对照相比，即使在更高的效靶比(100:1)下，用患者的新鲜PBMC进行的NK试验结果也未能显示出对K562肿瘤靶细胞有明显的细胞毒性水平(图2)。

环孢素- a治疗前细胞因子定量显示IL-4(112-147单位/ml)、IFN-γ (11-56 U/ml)水平升高。血浆中IL-2(结果未显示)、IL-1α和TNF-α水平在所有高IgE患者中均极低或未检测到。所有治疗后患者IL-4水平均显著降低(P<0.0001)(图3a和3b)。

图3:血浆中细胞因子IL-4和IFN-?3例HIE综合征患者应用CSA治疗前后。

T和B淋巴细胞的绝对数量与正常对照相比无明显变化。然而，与治疗开始时的正常人相比，所有患者的辅助T细胞数量都明显减少。T4(辅助T细胞):T8(抑制T细胞)比值显著低于沙特正常对照组(P<0.05)。CSA治疗后T4:T8比值明显升高，反映了T辅助性细胞增多，T抑制细胞减少。活化T细胞(Leu⁴/DR)也出现在所有患者中(表3)。

我们目前对HIE综合征(JOB’s)的病理生理学、发病机制和确切治疗的认识有限。严重的免疫失衡和免疫反应改变与HIE患者有关。一些免疫功能紊乱是由于常染色体显性的Hyper-IgE中转录激活因子(JAK-STAT)信号通路的缺陷，该信号通路由白介素IL-6和IL-2激活。这种缺陷导致T细胞辅助型Th17[3]受损。虽然目前免疫抑制剂CSA已被广泛用于预防异体移植物排斥反应，但也有报道成功地用于治疗各种皮肤病，特别是牛皮癣和严重特应性湿疹[24-31]。CSA是T细胞激活和随后产生多种免疫介质IL-2、IL-4和IFN-γ的有效抑制剂[32-35]。IL-4、IL-5和IL-13已被证明在人体内介导IgE合成，涉及B细胞、T细胞和单核细胞之间的复杂相互作用[36-39]。IgE产生的整个级联过程可由细胞因子积极或消极地调节。为了阐明HIE患者的潜在免疫机制，我们介绍了三名HIE患者的免疫表型、PBMC对PHA、PWM和IL-2的增殖反应、NK细胞的细胞毒性水平、各种细胞因子和免疫球蛋白水平的低剂量CSA治疗前后的结果。

在低剂量(60 ~ 200 μg/ml血浆水平)CSA治疗后，免疫球蛋白定量结果显示，3例患者的IgE水平均显著下降，IgM、IgG和IgA免疫球蛋白均未出现不良反应。在小鼠中，辅助性T细胞的亚群Th1和Th2负责细胞因子[40]的差异产生，这是一个公认的现象。Th1克隆在适当刺激下可产生IL-2、IFN-γ和TNF-α;而Th2克隆产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。IFN-γ已被证明是一种非常重要的抑制IgE产生的介质，而IL-4分子支持IgE的初级诱导和产生[6,41-43]。在人类T淋巴细胞功能中也观察到类似的二分法在体外[44]。我们的流式细胞分析结果支持这一观点，因为在HIE患者中T和B淋巴细胞的绝对数量没有改变，但在治疗前患者中观察到较低的T4:T8比率。PHA、PWM和IL-2的增殖反应结果表明，HIE患者的T细胞或承载IL-2受体的T细胞存在固有缺陷。与正常对照相比，所有三个预处理患者的NK细胞依赖性细胞毒性都明显较低。Wehrmann等人的一项早期研究表明，循环IgE[45]水平高的特应性患者NK细胞的数量和功能发生了改变。我们的研究结果在体外研究表明，较高浓度的IgE可降低调节杀手系细胞功能，提示IgE在HIE患者[46]中具有类似的作用。我们的PHA反应受损的结果与早期的研究不一致。然而，PWM在HIE患者中的反应一直存在争议，我们发现在CSA治疗前，PWM增殖反应有轻度到严重的抑制，而CSA治疗[13]有改善的趋势。本研究的细胞因子测定结果表明IL-1α、TNF-α和IL-2在HIE综合征的病理生理中没有显著作用。Mogensen和Ochs等人最近的报告发现，感染的易感性部分与Th17缺陷有关，Th17缺陷导致中性粒细胞增殖和趋化性降低，炎症和对念珠菌和细菌感染的易感性降低[3,47]。越早在体外使用PMA刺激HIE患者PBMC的研究结果也表明，诱导IL-2的产生在HIE患者[7]中受影响最小。我们发现治疗前HIE患者IL-4和IgE水平较高，证实了之前的研究[7]。这项研究最显著的发现是，在CSA治疗后，IgE和IL-4水平下降到正常对照水平。CSA治疗后，IFN-γ急剧下降至无法检测的水平(P>0.001)。

既往使用各种药物和免疫调节剂治疗HIE患者，包括左旋咪唑、西咪替丁、转移因子和抗坏血酸、异维甲酸、铬糖酸盐和反复血浆信息收集，均未能在这些患者中诱导长期的临床缓解[9-15,48]。虽然干扰素-γ显示在体外在调节HIE患者PBMC产生IgE方面，对治疗HIE患者[41]无明显临床效果。

在接受CSA治疗后，HIE患者的这种临床改善和免疫失衡的正常化是否持久且没有严重并发症，还需要进一步评估。经过两年的治疗，除了一名患者轻度多毛外，没有任何并发症的迹象。有一次，皮肤病变在CSA停止三天后突然发作，这至少表明皮肤改善与CSA治疗直接相关。

最近，低剂量环孢素- a已被用于治疗严重特应性皮炎，无严重并发症[31,49,50]。在各种皮肤疾病中使用CSA治疗后得到了类似的安全和有益的结果。HIE综合征和严重特应性皮炎患者对低剂量CSA的反应表明这些疾病之间存在共同联系。两人都有免疫失调，IgE分泌过多，严重瘙痒，反复皮肤感染金黄色葡萄球菌。这一联系需要进一步调查，以发现可能的共同机制引起的综合症。

尽管要阐明CSA治疗HIE患者的确切机制还需要做大量的工作，但本文讨论的结果对未来使用CSA治疗HIE患者是鼓舞人心的。一种新型的高免疫抑制剂FK506对IL-4诱导的IgE产生的影响也在研究中在体外，看看是否有类似的效果。