三维细胞培养用可调水凝胶的动态生物物理特性研究

近年来，三维(3D)细胞培养系统由于比传统的二维系统更准确地描述了体内细胞微环境而越来越受欢迎[1,2]。在二维培养中，细胞通过动态前缘丝状足[1]感知周围环境。然而，现在大家都知道，细胞也会挤出富含肌动蛋白的顶端和基底突起，如侵多足和足囊体，以在3D中感知和响应环境。3D培养系统具有诱导细胞分化、形态变化和功能反馈的能力，类似于活的有机体中的细胞，允许在类似生理状态下对细胞行为进行高效建模[1-3]。水凝胶在三维细胞培养系统中起着至关重要的作用。高含水量的基质结构提供了一个类似组织的环境，允许在3D中检查不同的细胞特征。

许多有机水凝胶，如胶原蛋白和基质凝胶，已被用于建立原生微环境的三维细胞培养。尽管这些水凝胶基质具有固有的功能特性，但它们对温度或pH值过于敏感，使得3D细胞培养不必要地费力。从动物组织中提取的基质在培养中产生了不需要的成分和未定义的化合物，并难以达到批与批的一致性[2,4]。由于这些原因，有机水凝胶体系的性质往往难以表征。然而，三维微环境中的细胞行为受生物物理水凝胶性质的影响很大，如刚度、密度、孔隙率、分子扩散、配体结合和组成[5-7]。需要更彻底的检查来评估当前3D细胞培养水凝胶的生物物理特性。与天然有机水凝胶不同，合成水凝胶具有更明确的分子结构和化学相互作用，为研究水凝胶的生物物理和生化性质提供了更可行和一致的平台[8-12]。

在本研究中，我们使用了一种无异种、可调的水凝胶体系(VitroGel)来表征水凝胶的流变特性，以响应离子分子、细胞培养基组成和补充葡萄糖和血清的变化。通过研究水凝胶浓度和离子溶液比例之间的关系，我们试图阐明离子调节水凝胶形成和最终弹性模量的影响。我们测试了水凝胶形成和稳定的不同阶段的流变特性，包括动态剪切减薄和恢复过程，以测试水凝胶注入的能力。用苯酚红、台虫蓝、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G (IgG)对不同水凝胶浓度和形成状态下的分子扩散特性进行了表征。最后，用胶质母细胞瘤癌细胞(U87MG)和骨髓基质细胞(OP9)评价不同功能配体修饰的水凝胶中的细胞行为[1,13-16]。这项研究说明了对离子反应水凝胶体系生物物理特性的基本理解。此外，我们提供了操作过程和培养条件的指导操作，证明了这种水凝胶在各种生物医学应用中的有用性[17-21]。

水凝胶的制备

离子分子的作用

为了制备离子分子诱导水凝胶，使用VitroGel 3D水凝胶溶液(TheWell Bioscience, NJ)与这两种氯化钙混合₂(0.15 - 1mg/ml)或NaCl (2 - 10mg/ml)溶液，比例为1:1 (v/v)。我们选择了8mg/mL NaCl溶液，这大约是钠的浓度⁺在PBS和其他常见细胞培养基中，研究混合比例对凝胶形成和强度的影响。水凝胶溶液与NaCl的混合比例为4:1 ~ 1:1 (v/v)。

此外，选择四种经典介质DMEM、DMEM/F12、RPMI和PBS(无钙、无镁、VWR和PA)，研究了介质中不同离子浓度对水凝胶形成的响应。按4:1、3:1、2:1、1:1(水凝胶溶液:介质，v/v)的混合比例制备水凝胶。

水凝胶浓度的影响

进一步采用DMEM和RPMI方法制备不同水凝胶浓度的样品。这里定义了两个比例:1)稀释比(水凝胶溶液与去离子水的比例)和2)混合比(稀释后的水凝胶溶液与细胞培养基的比例)，用于水凝胶制备。我们准备了两组样本。第1组:水凝胶溶液按1:1、1:2、1:3、1:4的比例(水凝胶溶液:DI水，v/v)稀释后与培养基混合。将稀释后的水凝胶溶液与DMEM按4:1 (v/v)的比例混合制备DMEM水凝胶样品。将稀释后的水凝胶溶液与RPMI按1:1 (v/v)的比例混合制备RPMI水凝胶样品。第二组:由于DMEM中水凝胶形成过程不稳定，本组使用1:3和1:4稀释水凝胶溶液。本组样品不采用固定的4:1混合比例(稀释水凝胶溶液:DMEM, v/v)，而是采用4:1、3:1、2:1、1:1的混合比例(稀释水凝胶溶液:DMEM, v/v)制备。

稀释溶液的影响

在使用去离子水调节水凝胶溶液浓度时，为了保证水凝胶形成过程的稳定，需要对稀释后的水凝胶溶液与细胞培养基的混合比例进行相应的调节，从而增加了实验操作的复杂性。因此，我们还评估了离子稀释溶液(VitroGel稀释溶液，TheWell bioscience, NJ)的影响，在改变水凝胶溶液的浓度后，离子稀释溶液可以与细胞培养基以固定的混合比例(4:1 v/v)使用。1型(含葡萄糖)和2型(不含葡萄糖)稀释液均用于本评价。样品按1:1、1:2和1:3的稀释(v/v)比例制备，然后按一个固定比例(4:1,v/v)与细胞培养基混合。三种经典的细胞培养基，DMEM, DMEM/F-12和RPMI用于本试验。

流变特性测试

水凝胶的流变特性通常通过观察两个过程来表征:水凝胶的形成和水凝胶的稳定。在水凝胶形成过程中，将水凝胶溶液与交联溶液(如氯化钙)混合后测试样品₂溶液，NaCl溶液或细胞培养基(DMEM, DMEM F12, RPMI或PBS)。采用Malvern Kinexus Pro+动态流变仪(Malvern Panalytical, UK)，在0.1%控制的剪切速率模型下，采用20mm平行平板粗糙表面几何形状，进行了30分钟的单频振荡时间扫描。在初始水凝胶形成过程后约30 min，在水凝胶上添加额外的细胞培养基，启动水凝胶稳定过程。为了测试稳定水凝胶的流变性能，在35mm的培养皿中制备1200 μ l样品;30min后，在凝胶表面加入1200µl的所选培养基，在37℃下孵育过夜，使水凝胶凝固。为了测试水凝胶随时间的稳定过程，样品孵育30分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，和24小时。样品在测试前冷却至室温15分钟。在测试前轻轻去除覆盖介质。

剪切稀化测试

使用Malvern Kinexus Pro+动态流变仪(Malvern Panalytical, UK)进行重复振幅扫描(剪切减薄和恢复)试验，该流变仪具有20毫米平行板粗糙表面几何形状。将190 μ l的VitroGel样品(1:0稀释和4:1混合)添加到0.5 mm间隙设置的下板上。加载样品后，用超低粘度的有机硅流体(粘度为5cSt @ 25C, Clearco, USA)覆盖样品边缘，以防止干燥。时间扫描测试在1hz, 0.1%剪切应变室温下进行30分钟，然后用0.1 - 500%剪切应变的振幅扫描剪切4分钟。第一次振幅扫描后，立即进行另一次时间扫描测试，持续10分钟，然后进行第二次振幅扫描测试。序列包含三个周期的时间扫描和振幅扫描。

分子扩散试验

采用含苯酚红(354.4 g/mol)、台虫蓝(960.8g/mol)、牛血清白蛋白(BSA, 6643g /mol)和IgG (150000 g/mol)不同分子量的颗粒溶液进行扩散试验。水凝胶样品按1:0、1:1、1:2稀释比(水凝胶溶液:稀释溶液，v/v)和4:1混合比(稀释水凝胶溶液:DMEM)制备。所得到的水凝胶(100µl)被添加到24孔板插入8.0µm PET膜。为了测试水凝胶形成过程后的扩散速率，将水凝胶添加到插入片30min后，在水凝胶上添加500µl的颗粒溶液。然后将插入物放置在24孔板中，每孔中有1ml DMEM。为了测试水凝胶稳定过程后的扩散速率，将插入物中的水凝胶覆盖500µl DMEM，放置在充满1ml DMEM的24孔板中孵育一夜。第二天，小心地取出覆盖介质，用颗粒溶液替换。在30 min、1 h、2 h、4 h、6 h和24 h时，用DeNovix DS-11分光光度计(DeNovix, DE)测定扩散分子的浓度。

三维细胞培养

用α MEM (α MEM) + 10%胎牛血清、1X Pen Strep和1X两性霉素b培养U-87 MG胶质母细胞瘤细胞株，培养至80%汇合时传代。根据制造方案将细胞嵌入水凝胶(未修饰的和用RGD整合素结合配体修饰的)。简单地说，用1型稀释液以1:3 (v/v)的比例稀释水凝胶溶液，然后与细胞悬浮液(5 × 10)混合⁵细胞/ml与50% FBS)，以4:1 (v/v)的比例。FBS在细胞-水凝胶混合物中的最终浓度为10%。将75 μ l的混合物添加到96孔板中。水凝胶形成20 min后，添加75µl细胞培养基覆盖水凝胶顶部。细胞在5%的CO中培养₂孵化器在37ºC。封面介质每隔一天更换一次。图像使用Image Xpress高含量分析系统(Molecular Devices, CA)拍摄。

不同离子分子水凝胶的流变性能

氯化钙样品

水凝胶样品是用含有0.15到1mg /ml氯化钙的溶液制备的₂．在高钙^2＋浓度(1mg/ml和0.5 mg/ml)，加速凝固过程，在10秒内，产生块状水凝胶(图1a和1b)。这种凝胶的快速形成导致了极其重要的连续水凝胶结构的丧失。因此，快速、不连续的水凝胶形成过程导致了高浓度的钙^2＋证明不实用的细胞培养应用，其中水凝胶必须从混合管转移到细胞培养板。浓度为0.15 ~ 0.4 mg/ml₂在凝胶形成的前500秒内，该图显示了弹性增加的初始曲线(图1c)。用0.4 mg/ml氯化钙形成水凝胶₂初始数据点超过20pa，表明混合后立即发生快速水凝胶交联过程。低CaCl水凝胶的曲线₂浓度为0.15、0.2和0.3 mg/mL时，其进展时间更长，表明水凝胶形成过程较慢。这在0.15和0.2 mg/ml氯化钙形成的水凝胶中尤其明显₂．凝胶形成过程越慢，水凝胶混合物制备和转移到培养皿的时间就越长。

在水凝胶稳定后，也评估了弹性模量(G’)(图1d)。0.4mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.2 mg/ml和0.15 mg/ml氯化钙水凝胶的G′₂分别为1270 Pa、2090 Pa、116 Pa和1.67 Pa。用0.3 mg/ml氯化钙的水凝胶₂G′高于0.4 mg/ml时的G′。由图1c水凝胶形成过程数据可知，水凝胶初始交联率与水凝胶强度呈负相关关系。相反，低离子浓度(0.2 mg/ml和0.15 mg/ml)的水凝胶在稳定后显示低G′。此外，与这两种离子浓度较低的水凝胶相关的缓慢形成过程(图1c)表明饱和水凝胶交联所需的离子分子数量不足。综上所述，这些结果表明水凝胶和钙之间存在着最佳的平衡^2＋形成稳定的高G '的水凝胶。这种平衡应该允许水凝胶形成的平滑初始化和最终水凝胶基质的饱和交联。

氯化钠的样本

我们进一步测试了离子浓度在水凝胶形成过程中的作用，通过检测主要阳离子对凝胶形成和最终凝胶强度的影响。与Ca比较^2＋， NaCl作为水凝胶交联剂。本文报道的结果证实，除了Ca^2＋, Na⁺离子可以在水凝胶基质的形成中发挥重要作用(图1e和1f)。相对于Ca^2＋, Na⁺离子浓度对水凝胶交联具有较高的启动阈值。图1e表明，凝胶形成在Na被证明是困难的⁺离子浓度为4 mg/ml。相反，当NaCl浓度大于6 mg/ml时，弹性模量曲线随时间增加而增加。当NaCl浓度为8 mg/ml时，水凝胶的弹性模量在400秒内开始呈直线上升趋势。有趣的是，当NaCl浓度高于8 mg/ml时，初始水凝胶的形成速度很快。例如，当浓度为9mg /ml时，G '在混合溶液后立即超过50pa，并在60秒内大于100pa。接下来，我们测量了Na的影响⁺水凝胶稳定后G′的浓度。图1f显示Na⁺浓度与最终凝胶强度的增加呈正相关。高浓度的钠⁺足以使基质饱和，从而有助于凝胶的形成。钠含量不足的凝胶⁺大部分保持液体状态(例如4 mg/ml样品，最终凝胶强度只有1.38 Pa)。

除离子分子浓度外，调节水凝胶形成的另一个因素是水凝胶溶液和交联溶液的混合比例。为了研究这一因素，将水凝胶与8mg/ml NaCl溶液按不同的混合比例(水凝胶:NaCl 4:1、3:1、2:1和1:1,v/v)混合。随着混合溶液中离子溶液比例的增加，即从4:1到1:1的混合比例，水凝胶的形成过程加快(图1g)，如图所示，弹性模量逐渐增大。相反，离子溶液比例增加，溶液中水凝胶浓度降低，这与水凝胶稳定后的最终G '有关。图1h显示过夜稳定后的水凝胶强度(G’)。G’从1:1的混合比880 Pa增加到2:1的混合比1400 Pa，最后增加到3:1的混合比1780 Pa。因此，混合比与最终凝胶强度呈正相关。然而，这种趋势似乎是有限度的。有趣的是，混合比例为4:1的水凝胶，其水凝胶溶液的比例更高(80% vs 75%)，比3:1的水凝胶具有更低的G '。根据水凝胶形成曲线，4:1混合水凝胶显示了非常缓慢的初始水凝胶形成(在30分钟的测量中G ' < 5 Pa)，提示由于离子溶液比例低，水凝胶交联是不饱和的(图1g)。 To manipulate the hydrogel formation process and modulate the final gel strength, the ratio of hydrogel solution to ionic solution needs to carefully consider.

图1:氯化钙水凝胶的流变特性₂和生理盐水的解决方案。(a) 1mg/ml氯化钙制成的块状凝胶₂(b)和0.5mg/ml氯化钙₂．(c)形成过程中的G′和稳定后的G′(d)不同浓度氯化钙制备的水凝胶₂．(e)形成过程中的G′和稳定后的G′(f)不同浓度NaCl制备的水凝胶。(g) 8mg/ml NaCl在不同混合比例(水凝胶:NaCl溶液，v/v)下制备的水凝胶形成过程和稳定后的g′(h)。

不同细胞培养基水凝胶的流变性能

在确立了Ca的作用和重要性之后^2＋和钠⁺在水凝胶的形成和聚合过程中，我们进一步测试了四种经典细胞培养基- DMEM, DMEM/F12, RPMI和PBS(无钙和镁)的流变水凝胶性能。这四种介质的钠浓度相似⁺和不同的Ca^2＋浓度如下:DMEM (~0.002 mol/L) > DMEM/F12 (~0.001 mol/L) > RPMI (~0.0005 mol/L) > PBS (0mol/L)。因此，我们预计这四种介质将对水凝胶的形成过程和稳定后的最终凝胶强度产生不同的影响。此外，我们还分析了不同水凝胶溶液和细胞培养基混合比例[4:1到1:1的比例(v/v)]的影响。

图2:采用DMEM、DMEM/F-12、RPMI和PBS制备不同配比水凝胶的流变性能。(a-d) 4种不同介质在4:1 (a) 3:1 (b) 2:1 (c)和1:1 (d)混合比下水凝胶形成过程的G′。(e)不同配比、不同介质制备的水凝胶稳定后的G′。

图2a-d显示了在水凝胶形成过程中四种介质的混合比例对G '的影响。在每种条件下，水凝胶的交联都发生在混合过程中，这可以从G '曲线随时间的增加得到证明。水凝胶的形成速度以DMEM最快，其次为DMEM/F-12、RPMI和PBS。不出所料，DMEM含有最高浓度的Ca^2＋在第0时间和第一个15分钟的测量中G′值都是最高的，这表明水凝胶的形成速度最快。然而，在2:1和1:1的混合比例图(图2c和图2d)中，DMEM DMEM/F12的水凝胶曲线(在1:1 v/v时)出现了倾斜，这表明交联过程中形成了非连续的基质结构。当细胞介质的比例从4:1增加到1:1时，DMEM和DMEM/F-12中离子分子浓度较高，导致水凝胶基质快速聚集，从而破坏了整体水凝胶基质的均匀性。另一方面，与4:1的混合比相比，RPMI和PBS的水凝胶在2:1和1:1的混合比下G '曲线增长更平稳。因此，在水凝胶溶液浓度固定的情况下，需要根据所使用的介质调整水凝胶形成的最佳混合比例。

图2e为水凝胶稳定后的弹性模量。在各混合比中，DMEM产生的G′最高(除了1:1比例，水凝胶不均匀)，其次是DMEM/F-12、RPMI和PBS。相反，对于每种测试的介质，随着混合比例从4:1减少到1:1，最终的G '减小，对应的是混合物中水凝胶溶液的比例减少。根据NaCl实验结果，如果离子浓度足以饱和水凝胶交联，水凝胶稳定后的最终G′对应于水凝胶溶液浓度。

调节最终水凝胶强度对于3D细胞培养水凝胶体系满足不同组织类型的要求至关重要[10,22]。对于3D细胞培养，与其通过调节水凝胶溶液和细胞培养基的混合比例来微调G’，不如通过预先调节水凝胶浓度的固定水凝胶溶液和细胞培养基的混合比例来确定细胞种子数量和生长因子浓度，这是一种更实用的方法。因此，我们进一步探索了水凝胶溶液的浓度与最终水凝胶G '之间的关系，采用固定的混合比例，预调水凝胶浓度。选择两种介质(DMEM和RPMI)来代表不同的离子浓度。DMEM使用固定的4:1混合比例，RPMI使用1:1混合比例，因为在这些比例下凝胶形成是光滑的。将水凝胶溶液按1:1、1:2、1:3、1:4稀释比例(水凝胶溶液:DI水，v/v)预先调整，然后与细胞培养基混合。

图3:用去离子水按不同稀释比例(1:1、1:2、1:3、1:4 -水凝胶:去离子水)稀释水凝胶的流变性能。(a) G’在水凝胶形成1:1 1:4稀释DMEM水凝胶以固定4:1混合比,(b) G’后水凝胶稳定1:4的1:1稀释DMEM水凝胶以固定4:1混合比,(c) G”在水凝胶形成1:1 1:4稀释RPMI水凝胶在固定1:1混合比,(d) G’后水凝胶稳定1:4的1:1稀释RPMI水凝胶在固定1:1混合比(e) G’在水凝胶的形成1:3稀释DMEM水凝胶在1:1混合比4:1,(f) 1:3稀释的DMEM水凝胶在固定的4:1 ~ 1:1混合比下稳定后的G’，(G) 1:4稀释的DMEM水凝胶在4:1 ~ 1:1混合比下形成水凝胶时的G’，(h) 1:4稀释的DMEM水凝胶在固定的4:1 ~ 1:1混合比下稳定后的G’。

图3a和3c显示了DMEM和RPMI在水凝胶形成过程中G′的时间增加。正如预期的那样，在水凝胶形成过程中(图3a和3c)以及水凝胶稳定后(图3b和3d)，水凝胶浓度与G′呈正相关。G′在RPMI水凝胶的所有浓度中均呈指数增长，但仅在稀释比为1:1和1:2的DMEM水凝胶中观察到。过程缓慢，曲线光滑，表明水凝胶形成稳定。而1:3和1:4稀释后的DMEM水凝胶G’增加缓慢，在30min后达到小于10 Pa。结果表明，在较低的水凝胶浓度下，混合溶液中离子分子的比例较高(RPMI水凝胶的混合比为1:1,DMEM水凝胶的混合比为4:1)可以使水凝胶稳定。为了进一步评估这一点，我们选择了用去离子水稀释1:3和1:4的水凝胶溶液，并以4:1、3:1、2:1和1:1的混合比例与DMEM混合(图3e-3h)。随着DMEM比例的增加，在两种稀释剂中形成的水凝胶G′都增加(图3e和3g)。水凝胶稳定后，在1:3和1:4稀释时，导致G '最高的混合比例分别为3:1和2:1(图3f和3h)。考虑到本文给出的水凝胶形成过程，一个好的阈值可能是在前30分钟内G’可以达到10pa以上。因此，如果水凝胶能够超过这个阈值，那么混合溶液中水凝胶溶液比例越高，稳定后G’值越高。 Based on the studies above, using DI water to adjust the hydrogel solution concentration requires a concomitant adjustment of the mixing ratio of diluted hydrogel solution and cell media to ensure stable hydrogel formation. This protocol may need further adjustment when using hydrogels for cell culture, especially for experiments requiring fixed cell seeding numbers. Therefore, we also evaluated the influence of ionic dilution solutions (VitroGel Dilution Solution), which can maintain a fixed mixing ratio (4:1 v/v) with the cell medium after adjusting the hydrogel solution with different dilution ratios. In addition, type 1 (with glucose) and type 2 (without glucose) dilution solutions were used to evaluate the effect of glucose on hydrogel formation. Figure 4a compares the type 1 and type 2 dilution solutions to DI water during hydrogel formation with a 1:3 dilution ratio and a 4:1 mixing ratio of DMEM. The results show the advantages of the dilution solution over DI water in accelerating hydrogel formation. The G’ curves of threshold within 500s of the hydrogel formation process. The exponential increase of G’ during hydrogel formation was also present when we tested different dilution ratios (Figure 4b for type 1 and Figure 4c for type 2). By using dilution solutions, the concentrations of hydrogel solution can be adjusted and subsequently mixed with different types of cell culture media at a fixed 4:1 mixing ratio. Figures 4d and 4e shows hydrogel formation of samples diluted with type 1 and type 2 dilution solutions respectively, at 1:3 dilution ratios. The sample was mixed with different cell culture media (DMEM, DMEM/F12, and RPM1) at the fixed 4:1 mixing ratio. Figure 4f shows the G’ after hydrogel stabilization. With the dilution solution, the final G’ is solely controlled by hydrogel solution concentration, showing the trend of 1:1 > 1:2 > 1:3 dilutions. The results show that both dilution solutions work well with different cell culture media at the fixed 4:1 mixing ratio.

图4:稀释溶液制备的水凝胶的流变性能。(a)用1型、2型和DI水(稀释比1:3)稀释，用DMEM(混合比4:1)混合的样品凝胶形成曲线。(b) 1型稀释液稀释样品和(c) 2型稀释液以1:1、1:2、1:3稀释比和4:1混合比与DMEM稀释样品的凝胶形成图。(d)用1型和2型稀释液按1:1 ~ 1:3稀释比例配制，与不同细胞培养基按固定的4:1混合比例混合的稳定水凝胶G′。(e) 1型和(f) 2型(1:3稀释比)混合DMEM、DMEM/F12和RPMI(4:1混合比)后的凝胶形成曲线。

为了更好地了解水凝胶随时间的稳定性，水凝胶样品以1:0到1:3稀释比和添加盖培养基24小时后。在每个时间点结束时测试G '，以量化水凝胶稳定过程。凝胶凝固后，水凝胶与覆盖介质之间可见清晰的凝胶-液相分离。在孵育期间对凝胶强度进行了量化，得到的图表显示随着时间的推移，凝胶强度逐渐增加(图5)。

图5:凝胶强度在孵育时间内被量化，得到的图表显示随着时间的推移逐渐增加。

对于DMEM水凝胶，样品在孵育6小时后达到各自稳定的G’(图5a)， RPMsI水凝胶在孵育4小时后达到稳定的G’(图5b)。由于RPMI中的离子浓度(Ca2+和Na+)比DMEM低，水凝胶更快地达到稳定点。总的来说，DMEM水凝胶的G′比RPMI水凝胶高，这可能是由于稳定过程中离子浓度更高和交联时间更长所致。

VitroGel系统具有独特的剪切稀释和快速恢复的流变性能，使水凝胶-细胞混合物易于移液，用于细胞培养应用和可注射动物研究。图6显示了DMEM水凝胶在重复振幅扫描测试下的G′，这允许评估动态流变特性。当剪切应变从0.1%迅速增加到500%时，水凝胶结构受到干扰(G '减小)。振幅扫描后，在0.1%的剪切应变下进行时间扫描测试，以评估G′的恢复。从图6可以看出，在500%剪切应变停止后，G’的恢复率超过60%，而在10 min时间扫描试验中，G’的恢复率几乎达到100%。通过在三个振幅扫描测试周期中表现出相似的G’模式，可以重复剪切减薄和快速恢复特性。可注射水凝胶需要具有剪切减薄和快速恢复的力学性能。在注射过程中，水凝胶会被挤出注射器，破坏其稳定的物理结构。剪切力作用下的流变性能是水凝胶在破坏后保持物理结构能力的重要指标[23,24]。

图6:DMEM水凝胶的G′表现出剪切减薄和快速恢复的特性。

分子扩散试验

为了评估分子在水凝胶中的扩散，我们使用了四种不同大小的分子(酚红、台盼蓝、牛血清白蛋白和IgG)。还考虑了以下不同的水凝胶条件:1)水凝胶形成过程中的分子扩散和水凝胶稳定后的分子扩散，2)不同水凝胶浓度下的分子扩散。图7a显示，最初的台盼蓝在水凝胶中孵育30分钟比过夜扩散更快(例如，实验前30分钟后，40%的台盼蓝可以通过30分钟水凝胶，而15%的台盼蓝可以通过过夜水凝胶)。尽管在隔夜水凝胶中最初的扩散速率较低，但在两种水凝胶条件下，分子最终在200分钟后完全扩散。图7b显示了台虫蓝扩散速率与水凝胶浓度的反比关系。从图7c可以看出，扩散速率高度依赖于扩散粒径。例如，苯酚红在1小时内达到扩散终点，并保持74%的浓度。台盼蓝在3小时后完全扩散。BSA在4小时内达到54%的稳定浓度，而IgG在2小时内达到28%左右的稳定浓度。药物筛选和细胞治疗研究依赖于3D系统促进细胞相互作用分子的吸收、分布、代谢和排泄的能力[19,22,24]。 These findings illustrate that this hydrogel system is suitable for such studies.

图7:水凝胶体系的分子扩散。(a)台盼蓝通过稳定30分钟和稳定一夜的水凝胶扩散。(b)台盼蓝在水凝胶中以1:0、1:1和1:2稀释后过夜稳定扩散。(c)酚红、台盼蓝、牛血清白蛋白和IgG在水凝胶中的扩散。

三维水凝胶系统细胞培养

U-87 MG细胞嵌入水凝胶中(未修饰和RGD整合素结合配体修饰)。水凝胶按1:3稀释(用稀释液)和4:1混合制备，以获得足够稳定的弹性模量来支持胶质母细胞瘤细胞。由于凝胶形成试验表明，在不同的细胞培养基范围内，凝胶形成稳定，因此选择4:1的混合比例。选择1:3的稀释比例来创建模拟人脑纹理的软环境，使胶质母细胞瘤细胞更真实地生长。图8a-8c显示V-3D(不含任何肽修饰的水凝胶)可以支持U-87 MG细胞的生长和增殖。有趣的是，在该系统中没有观察到典型的上皮(U87 MG)形态学(图8c)。然而，用整合素结合配体RGD修饰的水凝胶支持细胞类型特异性形态的发展(图8d-8f)。通过RGD修饰，引入可调水凝胶的生物活性，并研究其对细胞生长和形态的影响。RGD促进内皮细胞和成纤维细胞与细胞外基质的粘附，从而驱动细胞-基质和细胞-细胞相互作用。这些结果说明了用不同功能结合配体修饰的水凝胶刺激特定细胞反应的能力(图8f)。 This quality will allow researchers to manipulate the biochemical properties of the system, promoting the study of cell behaviors in more complex and physiologically relevant ways [25-28].

图8:显示第1天和第7天(10倍放大)U87 MG(嵌入未修饰的水凝胶，V-3D (a, b和c)和带有整合素结合配体的修饰水凝胶，V-RGD (d, e和f)。第1天的图像为a和d，第7天的图像为b和e。c和f是第7天的图像(b和e分别)的放大图像，以显示细胞的形态。用1型稀释液1:3稀释，加入αMEM和10% FBS 4:1混合制备水凝胶。

未定义的成分，温度不稳定和批次间基质不一致会使3D细胞培养困难。VitroGel®系统克服了这些障碍，因为它是无xeno，室温稳定和可重复性。结果表明，细胞培养基中存在的离子调节水凝胶交联，产生较大范围的基体刚度。水凝胶的剪切稀释特性使其可注射，允许液滴滞留在活的有机体内研究。该水凝胶还可以进行功能修饰，以诱导细胞-基质相互作用，使研究人员能够在更复杂和生理相关的环境中探索细胞反应。总的来说，水凝胶允许开发稳健的3D细胞模型，用于药物发现、癌细胞生物学、干细胞研究和许多其他基于细胞的应用。

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