病毒学与抗病毒杂志类别:医学类型:研究文章

孟加拉国牛羊病媒血液原生动物的鉴定

Md贾基尔哈桑 1Md Giasuddin 1Md Mamunur拉赫曼 2Md Ershaduzzaman 3.Mahmudul哈桑 1而且阿布哈迪努尔阿里汗博士 4
1孟加拉国牲畜研究所动物卫生研究处,萨瓦尔,达卡-1341,孟加拉国
2通过社区和商业养殖项目保护和改善本土羊,孟加拉国畜牧研究所,萨瓦尔,达卡-1341,孟加拉国
3.孟加拉国畜牧研究所系统研究部,孟加拉国达卡-1341萨瓦尔
4孟加拉国农业大学病理学系,孟加拉国迈门辛格

通讯作者(年代):
Md贾基尔哈桑
孟加拉国牲畜研究所动物卫生研究处,萨瓦尔,达卡-1341,孟加拉国
电话:+ 8801737840328,
电子邮件:zakir.vet@blri.gov.bd;zhtitas@gmail.com

收到的日期: 2019年9月6日
接受日期: 2019年10月7日
发布日期: 2019年10月14日
DOI:

摘要

巴贝西虫病无形体病而且Theileriais是孟加拉国最常见的媒介(蜱虫)传播的血液原生动物疾病(TBDs)。这项研究是在孟加拉国另一个地区对牛和羊进行的。从达卡、Sirajganj和Nikhangsori随机收集了1150份血液样本,用于血液涂片显微镜。然而,合并感染、温度、湿度、季节、耕作和预防也在考虑之中。对临床阳性样本进行PCR,然后进行凝胶电泳。外来羊、集约化养殖、奶区、本地牛、山地和本地羊的血液原生动物患病率分别为100%(55)、80%(320)、30%(120)、22%(44)、31%(22)、65%(16)。总患病率为50.17% (n=577)。在原生动物中,红孢子虫属种虫害是43%,巴贝西虫spp。19%,红孢子虫属种虫害的巴贝西虫spp。33%,spp 4%和红孢子虫属巴贝斯虫和Theileriaspp为1%。血液原生动物患病率在本地品种≥50%、≤75%和75%以上的杂交或纯种分别为17.58% (n= 103)、31.91% (n=187)和50.51% (n=296)。10 ~ 3月和4 ~ 9月血原虫感染率分别为16.041%(94例)和83.959%(492例)。在多聚酶链式反应红孢子虫属边际阳性条带为265 bp,Babesiabovis在166bp,和Theileriaannulata312年,英国石油公司Babesiaovis422年英国石油公司和Babesiamotasi分别在518个基点。因此,蜱是媒介动物,高湿度和高温是媒介传播疾病的主要危险因素。综上所述,血原生动物是家畜中隐伏的新发疾病,需要改进防治策略。

关键字

红孢子虫属spp;孟加拉国;聚合酶链反应;患病率;向量

介绍

红孢子虫属SPP是一种革兰氏阴性立克次体原生动物巴贝西虫spp,spp是一种感染红细胞(RBC)的尖复合寄生虫,确实是通过媒介叮咬传播给动物的,特别是硬蜱,通常被称为蜱传疾病(TBDs) (Karim等人,2012),而且在世界范围内分布[1,2]。寄生是孟加拉国畜牧业的主要障碍之一,炎热潮湿的气候条件极大地促进了外生寄生虫和内生寄生虫的生长和生存,使寄生变得暴力,被称为地方病[3]。杂交动物比本土牛更容易感染,在热带和亚热带国家,血原生动物以夏季为主,其次是冬季和雨季。成人和女性比年轻人和男性更容易感染[4]。临床表现为高热(105 ~ 1070f),贫血,腹泻多,腹水,有时有血性腹泻,晚期尿咖啡色巴贝西虫病[5]。世界上约80%的牛受到TBDs[6]的影响。孟加拉国的TBDS主要分布在森林和丘陵地区,高湿度和高温加剧了暴发,杂交或纯动物更容易感染[7]。湿热的气候条件有利于蜱和红细胞中血液原生动物的生长、繁殖和存活,从而引起TBDs[8]的暴发。它导致贫血、隐藏损害、减少牛奶产量和生殖性能差、增加死亡率和全球经济损失估计达187亿亿桶。在血液涂片显微镜中,B胞浆体病(Piroplasmosis)在红细胞中形成短环和长环,Anaplasmamarginale在RBC的外围和内部有一个尖尖的圆点AnaplasmacentraleRBC内的尖圆点。在哪里红细胞呈环状,有圆形、圆点、棒状。叮咬蝇传播疾病,由于炎热潮湿的环境,在性阶段繁殖增加[11]。通常康复的动物是持续性携带者。传统的印象涂片染色是一种常用的鉴别方法巴贝西虫而且红孢子虫属聚合酶链式反应(PCR)现在正成为分子检测的常用工具。康复的动物充当带菌者,值得注意的是,它形成了[13]的潜在传染源。用种特异性引物进行多重PCR,结果在166bp、265bp和312bp位点有选择性的阳性条带。,一个。边际和T。annulata在牛分别[14]。然而,红孢子虫属边际AnaplasmacentralBabesiaOvisBabesiamotasi而且Theileriaannulata是羊[15]中tbd的致病因子。早期诊断和特异性治疗以及病媒控制对于防止死亡和生产损失[16]是必要的。因此,考虑到tbd的重要性,重点对病媒性血液原生动物感染的鉴定和分子检测进行了研究巴贝西虫spp,红孢子虫属spp和孟加拉国牛和羊的spp有季节性变化。

材料和方法

研究区域

2016年7月至2017年6月,在达卡萨瓦尔的孟加拉国畜牧研究所(BLRI)动物卫生研究处的寄生虫学实验室进行了一项流行病学研究。

样品收集

从Savar、SirajganjSadar、ShajadpurUpazila和Nikhangsori的几个牛羊饲养场收集约2.5 ml外周血样本,Chottrogram在乙烯二胺乙酸四乙酸(EDTA)试管中,冷藏后转移到BLRI的寄生虫学实验室。采用问卷法随机采集1150份血样,其中澳大利亚羊55份,萨瓦尔高产奶牛场400份,巴坦奶牛场高产牛400份,本地牛200份,尼汉索里本地丘陵牛70份,本地羊25份。

吉姆萨染色法对血液原生动物的实验室鉴定

样本采用吉姆萨染色血涂片显微镜(GMS)检查(FAO, 2016),并通过聚合酶链式反应(PCR)进行确诊。本研究还考虑了地形、季节、年龄和性别的影响。在GMS方案中进行厚薄血涂片。风干后绝对甲醇固定,10%吉姆萨染色。洗涤后,风干乳化,放大率在100倍物镜以下。根据Soulsby[17]所示的特征形态,对血原生动物进行了显微鉴别。

蜱传原生动物(血原生动物)的分子鉴定与鉴定

血液原生动物DNA提取

血液原生动物DNA提取使用一种市售试剂盒(Invitrogen Purelink基因组DNA迷你试剂盒,Cat。不。K1820-01)通过氯仿法提取血样。一目了然,200 μl全血与含20μg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液200 μl混合,在55 0C孵育10分钟。然后在13000 x g的条件下洗涤和离心3分钟。最后,扔掉旋转柱,收集含有提取DNA的epppendorf管,在-20℃的冰箱中保存。用分光光度法(260°A/280°A)和1.5%凝胶电泳(Sigma Aldrich, USA)检测基因组纯度。DNA基因组压实量调整为100ng/µl核酸酶游离水。

多重聚合酶链反应(PCR)

在薄壁PCR管中以25μl的最终反应体积进行PCR扩增巴贝西虫红孢子虫属而且物种。商用主混合试剂盒(Thermo Scientific)用于在可编程热循环器(Eppendorf,德国)中扩增基因组DNA片段。此外,在95°C酶活化5分钟后,将反应混合物进行35个循环,每个循环包括95°C变性30秒,68°C退火30秒,72°C延伸1.5分钟。在72°C最后延伸5分钟后,用琼脂糖凝胶电泳拆分PCR产物,用溴化乙胺染色,然后在紫外光下观察。

在PCR扩增循环中使用寡核苷酸引物(First BASE Laboratories sdbhd, Malaysia)。通过计算机软件(Carl Zeiss, GmbH, Germany)捕获PCR图像,并根据PCR产物的特定条带大小检测阳性样本(表1)。

SL。

引物名称

序列(5 ' 3 ')

基因靶向/

参考文献

扩增子的大小

1

b羊属F1

(CCTGGGTAATGGTTAATAGGAACGG)

多拷贝VESA- 1a/ 422bp

Bilgic et al .,

2017

2

b羊属R1

(GCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTAAC)

多拷贝VESA- 1a/ 422 bp

Bilgic et al .,

2017

3.

b . Motasi F1

(CTCTGGTACAATATGCATTGC)

多拷贝VESA- 1a/ 518bp

Bilgic et al .,

2017

4

b . Motasi R1

(CTGGTTCCCAGATATGGTAGC)

多拷贝VESA- 1a/ 518bp

Bilgic et al .,

2017

5

答:羊属F1

(CAGCCAGGCACTCTGCACCAC)

多拷贝视频电子设备标准协会- 1 /

Bilgic et al .,

265个基点

2017

6

答:羊属R1

(CAACAATTGATGTGAGTGCGC)

主要表面蛋白-1b / 265bp

Bilgic et al .,

2017

7

答:保证金F1

(GCTCTAGCAGGTTATGCGTC)

主要表面蛋白-1b / 265bp

Bilgic et al .,

2013

8

答:保证金R1

(CTGCTTGGGAGAATGCACCT)

主要表面蛋白-1b / 265 bp

Bilgic et al .,

2013

9

t . Anulata F

(ACTTTGGCCGTAATGTTAAAC)

细胞色素b /312 bp

Bilgic et al .,

2013

10

t . Anulata R

(CTCTGGACCAACTGTTTGG)

细胞色素b /312 bp

Bilgic et al .,

2013

11

b宝F

(CAAGCATACAACCAGGTGG)

多拷贝VESA- 1a/ 166bp

Bilgic et al .,

2013

12

R b宝

(ACCCCAGGCACATCCAGCTA)

多拷贝VESA- 1a/ 166bp

Bilgic et al .,

2013

表1:用PCR产物的特异性条带大小检测阳性样品。

结果与讨论

在血涂片显微镜下,澳大利亚羊的TBDs患病率为100% (n=55),奶牛场为80% (n=320), Bathan地区为30% (n=120),本地牛为22% (n= 44),丘陵牛为31% (n=22),本地羊为65% (n=16),这一发现有力地支持了他发现的TBDs患病率随地区、季节和品种的显著变化(表2)[18]。

样本区域类型

不。总样本的

积极的样本

负样本

阳性样本百分比

澳大利亚羊/孟加拉畜牧研究(纯)

55

55

0

100%

高产牛(杂交),牛奶Vita Baghabari。

400

120

280

30%

本地牛、Sirajganj

200

44

156

22%

本地丘陵牛,Nikhongchori

70

31

39

44%

在公认的奶牛场,贾姆古拉,萨瓦尔

400

320

80

80%

本地羊,位于

25

16

9

21.29%

总计

1150

586

564

50.96%

表2:不同地区血原生动物流行情况分析。

牛、羊tbd总患病率为50.17% (n=577),其中无浆体占43%;巴贝西虫spp 19%,红孢子虫属种虫害和巴贝西虫spp 33%,spp 4%和红孢子虫属种虫害的巴贝西虫而且spp血液原生动物1%(表3)。

阳性样本总数

血液原生动物的类型

积极的没有。血原生动物

血原生动物阳性菌%

586个(1150个)血样)

红孢子虫属仕达屋优先计划

251

43%

巴贝西虫仕达屋优先计划

113

19%

红孢子虫属spp +巴贝西虫仕达屋优先计划

193

33%

焦。

23

4%

红孢子虫属种虫害的巴贝西虫而且仕达屋优先计划

6

1%

表3:按血型分类的血原生动物患病率。

这一结果与土耳其的总体患病率为74.78%几乎相似,红孢子虫属spp和巴贝西虫SPP为41.99%,略高于总患病率的38%,但由于热带和亚热带地区的差异,存在一定的差异[19,20]。阳性情况下,血原生动物放大成微紫色。在的情况下巴贝西虫在红细胞外围形成短环和长环(梨胞浆菌病)。在的情况下红孢子虫属边际在RBC的外围和内侧有一个尖的圆点AnaplasmacentraleRBC内的尖圆点。在的情况下红细胞呈轻微的三角形和环状spp呈环状,有时呈椭圆形、圆形、圆点、棒状,这一发现与(图1)[21]明显相似。

图1:血液涂片显微镜巴贝西虫spp,红孢子虫属spp和RBC内部的spp有100个目标。

然而,红孢子虫属边际阳性带为265 bp,Babesiabovis在166bp,和Theileriaannulata在牛血中,3312 bp红孢子虫属边际265年英国石油公司Babesiaovis422年,英国石油公司Babesiamotasi518年英国石油公司和Theileriaannulata在绵羊血液中的312 bp中,这一发现与(图2)[22]明显显著。

图2:分子检测红孢子虫属spp,巴贝西虫spp和通过多重PCR(凝胶电泳扩增DNA)检测。

然而,在孟加拉国的季节性研究中观察到,4月至9月的环境温度升高(超过300°C,有时400°C),湿度超过70%(有时超过90%),这在生物学上触发了蜱虫的繁殖,同时蜱虫和动物血液中tbd原生动物的繁殖,导致了高产量动物和当地动物作为载体的tbd的破坏,这一澄清也清楚地证明了相同的发现。在那里,他说绵羊的感染52%是由于炎热潮湿的环境条件[23]。

此外,当10 - 3月环境温度在300℃以下,湿度在70%以下,动物作为带菌动物但无临床表现时,10 - 3月血液原生动物患病率为16.041% (n= 94), 4 - 9月为492 83.959% (n=492),验证了研究结果(表4)[24]。

月的名字

BD地区平均气温

BD区平均湿度

血液原生动物的流行

10月至3月

30.0C或低于

70%或以下

94例(16.041%)

4月到9月

30°C到40°

70%到90%

492例(83.959%)

阳性样本总数(1150例)

586

表4:以温度和湿度为基础的血液原生动物流行率。

高产动物(60%以上杂交)和100%纯种动物临床体征高,甚至死亡率高,治疗反应低。在本地品种或50%杂交品种中,高达75%杂交品种和超过75%甚至纯血原生动物患病率分别为17.58% (n= 103)、31.91% (n=187)和50.51% (n=296)(表5)。结果表明,杂交品种比本地动物更容易感染TBDs,因此,TBDs在高产量动物中比本地反刍动物造成较高的发病率、死亡率和经济损失[25-27]。

品种类型(根据养殖户历史)

正样本数

血液原生动物流行率

本地或交叉可达50%

103

17.58%

越过50%到75%

187

31.91%

75%以上交叉至以上或纯)

296

50.51%

阳性样本总数586(1150个样本中)

表5:按品种划分的血原虫患病率。

结论

蜱虫传播的血液原生动物病(巴贝西虫病,无形体病而且Theileriosis)现在是孟加拉国畜牧业生产的一个关键因素。本地动物是一个载体,但它预示着未来畜牧业的大破坏,特别是高产的外来动物(70%到100%纯种)。此外,它们更容易感染tbd,由于高温和湿度刺激了蜱的繁殖,非常难以控制。在农场引进高产动物,严格的生物安全是农业生产的必要条件。

确认

作者谨向孟加拉国畜牧研究所动物卫生研究处寄生虫学系的所有研究人员表示感谢,感谢他们开展了这一面向问题的寄生虫研究监测。

免责声明

作者已经声明,这篇手稿的出版没有利益冲突

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引用:Hassan MZ, Giasuddin M, Rahman MM, Ershaduzzaman M, Hasan M,等(2019)孟加拉国牛羊病媒携带血液原生动物的鉴定。抗病毒病毒2:004。

版权:©2019 Md Zakir Hassan,等。这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布,该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是注明原作者和来源。

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