不同氧张力对马脂肪组织和脐血间充质干细胞(hr - at - msc和hr - ucb - msc)培养和生长模式的影响

间充质干细胞

hr - msc:马间充质干细胞

hr - at - msc:马脂肪组织来源间充质干细胞

Hrs-UCB-MSC:马脐血来源间充质干细胞。

乙二胺四乙酸

DMEM: Dulbecco 's Modified Eagle Medium

胎牛血清

PBS:磷酸盐缓冲盐水

DPBS:杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水

荧光素激活细胞分选

O₂:氧

干细胞生物学最近引起了人们极大的兴趣。希望它能通过移植疗法在许多不治之症的治疗中发挥重要作用。已经分离和鉴定了几种类型的干细胞在活的有机体内而且在体外．广泛地说，它们包括两大类:胚胎间充质干细胞和成体间充质干细胞。猪、兔、狗、绵羊和山羊骨髓间充质干细胞的分离、增殖和形态学特征已被报道。从马种中分离出的间充质干细胞已在许多不同的组织中得到报道，包括骨髓[2]、脂肪组织[3]、脐带血[4]和外周血[5]。来自脂肪组织和脐带血的马间充质干细胞显示出在适当的培养条件下，利用骨、软骨和脂肪等中胚层血统的特定激素和生长因子进行分化的能力[3,4]。

MSC用于组织工程目的及其在骨、软骨、脂肪和肌肉谱系中分化的潜力已被证实，其在再生医学方法中的用途是明确的。骨髓间充质干细胞可能通过多种方式发挥其有益作用。它们可能直接分化并作为一种新的细胞类型发挥作用，但它们也可能通过营养因子的释放间接发挥作用，以履行内分泌/旁分泌的作用。从自体供体部位获得的它们是相对无害的，而且很容易培养在体外为重新植入[7]获得足够的细胞数量。

细胞最佳培养条件的问题已经研究了多年。一个重要的考虑因素是培养细胞的最佳氧张力。生理氧张力在血液中最高可达12%，在软骨区[8]深区低至1%。骨髓中的氧张力被描述为4%到7%[9]之间。在任何情况下，氧张力都大大低于标准细胞培养[10]的大气氧张力(21%)。

氧张力是骨髓间充质干细胞培养的一个重要参数。它是干细胞生物学所有主要方面的重要生化信号分子，包括自我更新、增殖、细胞死亡、分化和迁移[8,11]。缺氧在各种病理生理过程和组织再生中起着关键作用。减少了啊₂浓度影响MSC活力和增殖活性，从而调节组织中的修复过程。缺氧条件下MSC培养实验表明，研究低氧环境下MSC各方面功能的必要性₂浓度[12]。

本研究研究了常氧(21%)和低氧(5%)氧张力对来自脂肪组织(hr - at -MSC)和脐血(hr - ucb -MSC)的马间充质干细胞(MSC)增殖、活力和表型特征的影响。

材料

我们使用Dulbecco改性鹰培养基(DMEM) (Gibco)含有100U/ml青霉素，100mg /ml链霉素，10%胎牛血清(Gibco)，培养瓶和培养皿(Nunc)用于细胞培养，磷酸盐缓冲盐水(20mM, Gibco)用于细胞洗涤;0.02%胰蛋白酶与0.05% EDTA (Gibco)用于细胞收集。

细胞生存能力测试

采用丙碘(Pi)染色流式细胞荧光法测定细胞活力。在连接数码相机的Axiovert 25相位对比显微镜(蔡司)下评估MSC的形态学特征。在常氧或低氧条件下培养第0、1、2、3、4、5、6、7和8天，用Casy I细胞计数法测定MSC培养物的增殖活性。采用非参数Mann-Whitney检验估计差异显著性。

该研究采用从马脂肪组织和脐带血分离的MSC培养物的1-4代进行。

MSC隔离

如前所述[3,4]，从马供体中分离出脂肪组织和脐带血来源的间充质干细胞。对于UBC血，按照制造商的说明，使用市售试剂盒获取细胞，然后进行Ficoll-Paque密度梯度离心，并在膨胀培养基(Gibco)的无涂层组织培养烧瓶中镀膜。让细胞粘附一夜，用培养基改变将非粘附细胞洗掉。中等变化之后每周进行两次。

限制稀释

7-10天后，在接近培养汇合处，用胰蛋白酶/EDTA分离细胞。细胞以5 × 10的倍率传代^3.细胞/厘米²培养至2代(P2)汇合80-90%。

维护和文化拓展

一旦粘附细胞达到约80% - 90%的汇合，用胰蛋白酶- edta分离细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，离心，1000转，5分钟，在Co₂培养箱用于下一次传代。

缺氧条件下

在密封的室内(干细胞技术)通过输送95% N的气体混合物诱导培养基缺氧₂和5%的公司₂直到阿₂浓度降至5% O₂用室内传感器监测含量和气体压力。对照细胞置于CO中₂培养箱在标准常氧条件下(5% CO₂, 21%的人啊₂)．

菌落形成单位-成纤维细胞分析(免疫照相分型)

单个核细胞分离后(P4)， 2x10⁴MSC /厘米²接种于10cm的培养皿中。14天后，PBS冲洗菌落，甲醇固定5分钟。取出并风干(5分钟)后，在吉姆萨染色液中培养5分钟。培养液用水清洗两次，计数有超过50个MSCs的菌落。

流式细胞术/ Immunophenotyping

约3×10⁵hr - at - mscs和hr - ucb - mscs 500g离心5min，悬浮于含1%人血清白蛋白(w/v)的50 μl PBS中，标记偶联一级抗体(Integrin alfa 5)。样品在室温下孵育30分钟。采用流式细胞仪(FC;FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, california, USA)和CellQuest软件。为了通过光的正向和侧向散射来测定细胞，该仪器采用微珠标准化(Dynosphere Uniform Microspheres, Bangs Laboratories, Fisher Scientific, USA)。

细胞周期分析

21% O细胞适应7天和21天后进行MSC细胞周期分析₂和5%啊₂．1 x10⁶MSC用磷酸盐缓冲盐水冲洗三次，用70%乙醇冷冻固定，4℃保存^ºC至少1小时。PBS洗涤三次后，用碘化丙啶对间充质干细胞DNA进行染色。样品在室温下孵育15分钟，用流式细胞仪在FACS口径(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)上进行分析。

原代培养的hr - at - msc和hr - ucb - msc均由相同类型的细胞组成，并积极增殖。然而，经过传代培养后，MSC群体变得异质化，包含多种形态特征和增殖活性不同的细胞。两种类型(AT和UCB) MSC的培养均包括以下细胞:细胞质均匀、增殖活跃的梭形或三角形细胞;细胞核大的成纤维细胞样细胞增殖扩散活跃;缓慢增殖和高度扩散的细胞具有多边形，椭圆形，或不规则的形状和异质细胞质。大多数培养物的增殖活性降低4^th传代、缓慢分裂和扩散的细胞占优势。进一步的继代培养消除了这种所谓的“增殖抑制”，增殖活性增加并保持在较高水平，这导致在培养中形态相似的细胞占主导地位。

研究了MSC在不同培养条件下的形态特征。常氧刺激胞质均匀的小细胞形成胰岛。这些细胞彼此密切接触，形成菌落。常氧条件下菌落数量和大小较高。常氧还伴随不同大小和形态特征的大细胞、扩散细胞和缓慢分裂细胞的比例减少。常氧降低了间充质干细胞培养的异质性，增加了相似类型小细胞的比例。而在缺氧条件下，细胞大小、细胞集落和细胞增殖活性降低。在缺氧条件下，间充质干细胞表现出明显不同的形态，延伸更短，细胞体更宽(图1)。

图1:不同O₂张力:常氧条件下AT (a)和UCB (b)衍生h - MSC的形态学;AT (c)和UCB (d)在缺氧条件下的形态。

hrs-MSC在标准培养条件下培养7天后的细胞周期分析显示，只有1.67%的MSC进入G₂与之相比，在氧浓度为21%时，细胞培养的存活率为2.80%。

在缺氧条件下，间充质干细胞的增殖速度不如在21%氧气条件下(图2)。

图2:不同氧张力条件下hrs AT-MSC细胞的增殖。

在常氧条件下，hr - at - msc和hr - ucb - msc的细胞数量均高于缺氧条件(表1)。

Normoxia	缺氧
•hr - at - msc: 811万/ml •hr - ucb - msc: 366万/ml •平均直径： hrs-AT-MSC: 17.43µm	•hr - at - MSC: 809万/ml •hr - ucb - msc: 359万/ml •平均直径： hrs-AT-MSC: 16.95µm

表1:细胞数和细胞直径。

hrsMSC在不同氧张力下的生存能力如图3所示。在常氧条件下，hr - at - msc和hr - ucb - msc的活力均高于低氧条件。

图3:hrs间充质干细胞在不同O₂张力:常氧(a)、缺氧(b)下AT-MSC小时;hrs UCB-MSC在常氧(c)，缺氧(d)。

14天后，来自2x10的培养物⁴单核hr - at - msc (P4) 5% O₂CFU-F值为24±5,CFU-F值为21%₂平均47±6，比5% O高约2倍₂文化。除了CFU-F数量的差异外，高氧(常氧)环境中的菌落直径更大(图4)，这与21%氧浓度下的增殖增加一致₂．

图4:在常氧(f)和缺氧(g)条件下生长的间充质干细胞的集落形成单位活性。

在5%氧张力环境下，间充质干细胞表现出明显不同的形态，细胞延伸较短，胞体较宽，而在常氧(21%氧张力)环境下，间充质干细胞表现出典型的纺锤形，胞质延伸较长₂)环境(图5)后Giemsa染色。

图5:吉氏染色后间充质干细胞的形态。

在常氧条件下AT-MSC和UCB-MSC中，整合素α 5表达的免疫表型高于缺氧条件下(图6)。

图6:整合素α 5的FACS表达: a)常氧条件下AT-MSC小时数，b)缺氧条件下AT-MSC小时数，c)常氧条件下UCB-MSC小时数，d)缺氧条件下UCB-MSC小时数。

在常氧条件下，马干细胞的细胞数量、细胞集落和细胞大小、细胞增殖均高于缺氧条件。MSC的异质性也小于缺氧。可以推测，培养中MSC增殖活性低反映了缺氧培养过程中氧化应激条件下损伤的严重程度(5% O₂)．细胞周期分析显示更多的细胞进入G₂/M相在常氧条件下比在低氧条件下。G₂/M期证实了氧浓度降低对MSC增殖的抑制作用。常氧显著增加MSC增殖活性，这与已发表的数据[13]一致。在常氧条件下培养到第8天，细胞数量是低氧条件下的2.1倍。hrs-AT-MSC和hrs-UCB-MSC在常氧培养下的活力高于缺氧培养，其他工蜂[13]也认为如此。

在常氧条件下AT-MSC和UCB-MSC中，整合素α 5表达的免疫表型高于缺氧条件下。在常氧条件下，两种MSC (hr - at -MSC和hr - ucb -MSC)的分化比在缺氧环境[13]中更好。细胞表面受体的整合素家族似乎在细胞-细胞外基质(ECM)相互作用中起着重要作用，与周围组织的结构和功能变化相关。整合素是由α亚基和β亚基组成的异二聚糖蛋白。整合素介导的信号通路参与多种细胞过程，如分化、粘附和迁移。整合素介导的信号通路似乎在来源于骨髓和脂肪组织的干细胞中成骨细胞和软骨细胞分化的产生和维持中发挥着重要作用[14,15]。在我们的研究中，在常氧条件下AT-MSC和UCB-MSC中，整合素α的表达比缺氧条件下更多。整合素α可能是脂肪组织来源间充质干细胞培养和增殖[16]良好的免疫光分型标记物。

标准氧浓度在体外培养的原代动物细胞往往不适应在活的有机体内的情况。氧是干细胞生物学[13]的重要调节因子，这一点越来越明显。处于缓慢循环状态的MSC可能更容易免受复制过程中错误引起的DNA损伤以及游离氧基物种的伤害。在这方面，与大气氧水平相比，MSC在低氧水平下不增殖和分化就不足为奇了。虽然我们没有分析培养期间的染色体畸变，但在传统培养条件下的高氧张力可能有利于突变。因此，作为安全措施，我们将我们研究所用于动物MSC临床应用的培养期限制在4到5周。Holzwarth等人[13]在低氧(5% O₂)和常氧(21% O₂)条件。众所周知，低氧张力与保持干细胞处于静止状态有关，保持其可塑性[17]。氧张力降低使人间充质干细胞[18]的分化能力减弱。缺氧影响间充质间质细胞成骨分化和血管生成因子[19]表达。然而，不同工作者的报道也有一些相互矛盾的，他们报道了缺氧增加了细胞的MSC增殖活性，也没有对MSC产生不良影响。在缺氧条件下培养2周的间充质干细胞增殖和活力增强。在长期培养过程中，缺氧延迟了MSCs的表型变化，如细胞体积增加、形态改变和衰老相关β-gal的表达，但没有改变其特异性免疫表型特征[20]。这些结果的不一致可能是由于实验设置的一些变化，包括(i)使用来自不同物种的MSC，即啮齿动物和人类;不同的媒介成分，特别是生长因子的来源和数量;(iii)氧气浓度在8%到1%[13]之间的细微差别。

本研究结果表明，缺氧(5% O₂张力)在体外从脂肪组织和脐血中提取的马间充质干细胞的培养减缓了细胞数量、细胞周期进展、细胞分化和活力。

1. Maiti SK, Shiva Kumar, Srivastava L, Ninu AR, Kumar N(2013)不同动物骨髓间充质干细胞的分离、增殖和形态特征。趋势生物生物Artif器官27:29-35。
2. Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE(2003)从骨髓分离自体马间充质干细胞并将其植入到指屈肌腱表面作为一种潜在的新治疗方法。马兽医杂志35:99-102。
3. Vidal MA, Kilroy GE, Lopez MJ, Johnson JR, Moore RM, et al.(2007)马脂肪组织来源间质细胞的特性:成脂和成骨能力以及与骨髓来源间质细胞的比较。兽医36号:613-622。
4. 科赫TG, Heerkens T, Thomsen PD, Betts DH(2007)从马脐带血中分离间充质干细胞。BMC生物技术7:26-34。
5. Koerner J, Nesic D, Romero JD, Brehm W, Mainil-Varlet P, et al.(2006)马外周血源性祖细胞与骨髓源性间充质干细胞的比较。干细胞24:1613-1619。
6. Pittenger MF, Martin BJ(2004)间充质干细胞及其作为心脏治疗的潜力。Circ Res 95: 9-20。
7. Das R, Jahr H, Gerjo JVM, Osch V, Farrell E(2010)缺氧在骨髓来源间充质干细胞中的作用:对再生医学方法的考虑。组织工程B部分Rev 16: 159-168。
8. Csete M(2005)氧在干细胞培养中的作用。安纽约科学学院1049:1-8。
9. Lennon DP, Edmison JM, Caplan AI(2001)在低氧张力下培养大鼠骨髓间充质干细胞:对体外和体内成骨的影响。《细胞物理学报》187:345-355。
10. 缺氧或原位常氧:干细胞范式。细胞生物学杂志，19(4):361 - 361。
11. Rochefort GY, Delorme B, Lopez A, Herault O, Bonnet P, et al.(2006)缺氧可动员多潜能间充质干细胞进入外周血。干细胞24:2202-2208。
12. Burakova LB, Anokhina EB(2007)缺氧对培养早期大鼠骨髓基质前体的影响。牛体外生物医学143:386-389。
13. Holzwarth C, Vaegler M, Gieseke F, Pfister SM, Handgretinger R，等(2010)低生理性氧张力降低人多功能间充质间质细胞的增殖和分化。BMC细胞生物学11:11。
14. Goessler UR, Bugert P, Bieback K, Straeter JS, Bran G，等(2008)骨髓和脂肪组织干细胞在成软骨分化过程中整合素的表达。中华医学杂志21:271-279。
15. Navarrete RO, Rodil SE, Hyzy SL, Dunn GR, Flores AA，等。(2015)整合素亚基在石墨碳涂层微结构表面间充质干细胞分化和成骨细胞成熟中的作用。生物材料51:69 - 79。
16. Maiti SK, Wouters G, Spitkovsky S, Hescheler J(2021)不同血清对马脂肪来源间充质干细胞(hr - at - msc)培养和生长模式的影响。干细胞研究与治疗杂志7:12-16。
17. D'Ippolito G, Diabira S, Howard GA, Roos BA, Schiller PC(2006)低氧张力抑制成骨分化并增强人迈阿密细胞的干性。骨39:513 - 522。
18. Fehrer C, Brunauer R, Laschober G, unterragauer H, Reitinger S, et al.(2007)氧张力降低衰减人间充质干细胞的分化能力并延长其寿命。老化细胞6:745-757。
19. Potier E, Ferreira E, Andriamanalijaona R, Pujol JP, Oudina K，等(2007)缺氧影响间充质间质细胞成骨分化和血管生成因子表达。骨40:1078 - 1087。
20. Kim DS, Ko YJ, Lee MW, Park HJ, Park YJ，等(2016)低氧张力对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。细胞应激伴侣21:1089-1099。

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