血迹模式分析是法医学的一个领域，通过分析血液的大小、形状、飞溅模式等物理特征，可以重建流血犯罪现场，在某些案件中可以通过确定嫌疑人供述的真实性和对嫌疑人的估计来帮助破案。根据犯罪现场的BPA, DNA分析可以在更准确地重建多人血迹混合的犯罪现场的基础上，对破案有很大的帮助。通过认识到能够准确识别个体的DNA标记系统的重要性，人们开展了大量专注于DNA多样性和稳定性的研究，这些研究可以改进现有的在各种法医研究中的使用。因此，我们使用一种开发的血液替代品和合成DNA来测试不同DNA序列或大小的组合，通过与已有的方法相结合的多样化分析来增加BPA的可用性。在本研究中，我们将合成的DNA应用于开发的血液替代品，通过PCR鉴定其大小，从而确定开发的血液替代品的特征。据此，我们建立了在研制的血液代用品中扩增合成DNA的条件，并通过合成DNA稳定性试验进行了验证。通过添加本研究设计和生产的合成DNA，我们能够使强调现有物理特性的血液替代品多样化。通过这样做，我们可以提高开发的血液替代品的可用性，使其可以像从人类血液中进行DNA分析一样被识别出来。
血迹模式分析(BPA)是法医学的一个领域，通过分析血液的大小、形状、飞溅模式等物理特征，可以重建流血犯罪现场，对一些案件可以通过确定嫌疑人供述的真实性和对嫌疑人的估计来帮助破案[1,2]。为了了解犯罪现场血迹的产生机制，最终确定血迹的特征并重建现场，必须验证通过实验得到的众多解释中最能解释现场的假设，以确保科学的可靠性。这一点很重要，因为BPA的结果可以作为法庭上的证据。从实验对象身上采集的人类血液，从屠宰场供应的动物血液(牛或猪)，以及其他国家开发的血液替代品(Arrowhead, Sirchie，美国的Tri-Tech Forensics)目前都用于BPA实验。但由于血液替代品存在各种问题，不适合进行实验，使用不方便[3,4]。为了解决这些问题，许多科学家如[3,5 -8]对合适的血液替代品进行了大量的研究。根据犯罪现场的BPA，通过每种类型BPA的DNA采样来识别个体是至关重要的[9,10]。然而，DNA分析没有得到充分利用，实际上不可能检测所有的血迹。因此，如果没有足够的案件细节，在现场观察到的血迹通常被认为属于受害者，并进行相应的分析[11]。但是，犯罪嫌疑人可以做多种事情来掩盖血迹，不能排除第三方的血迹，DNA分析可以在更准确地重建多人血迹混合的犯罪现场的基础上，对破案有很大的帮助[12]。
通过认识到能够准确识别个体的DNA标签系统的重要性，人们开展了大量关注DNA多样性和稳定性的研究，这些研究可以改进现有的各种法医研究中的使用[13,14]。因此，在本研究中，我们使用[3]和合成DNA的血液替代品(NFBS)来测试不同DNA序列或大小的组合，通过结合已有的方法进行多样化分析，以增加BPA的可用性。在本研究中，我们合成了如[14]所示的合成DNA，将该DNA应用于NFBS，通过PCR鉴定其大小，从而鉴定出NFBS的特征。据此，我们建立了在NFBS中扩增合成DNA的条件，并通过合成DNA的稳定性试验进行了验证。此外，为了重现我们需要识别来自多人的血迹的情况，我们将合成DNA (72bp)用于先前研究中用于荧光膏体的NFBS，同时使用两种不同大小的合成DNA (90bp和140bp)，生成了三种不同的NFBS(图1)。三种可识别的NFBS可用于三名受试者的重建和，我们可以根据情况添加不同的合成DNA，为双酚a的教育和训练包括三个或更多的主题。三种不同大小的合成DNA的NFBS可以通过电泳通过扩增产物的大小快速、容易地识别。其中，将两种NFBS按不同比例混合，假设混合血液状况，采用real-time PCR方法量化每种不同大小的合成DNA在NFBS中的比例，估计混合血液的比例。其中，将两种NFBS按不同比例混合，假设混合血液状况，采用real-time PCR方法量化每种不同大小的合成DNA在NFBS中的比例，估计混合血液的比例。基于此，我们的目标是通过NFBS的多样化和实用性来增加BPA研究和测试的可用性，进一步帮助解决流血犯罪。
图1:模拟实验图
合成DNA的设计与合成
合成DNA由a, G, C和T的随机组合组成，长度分别为90bp和140bp。为了排除随机设计的DNA被污染和扩增的可能性，我们通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的“BLAST”搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对DNA序列进行了验证，确认没有完全匹配的序列。用于DNA合成和聚合酶链反应(PCR)的引物由Bioneer公司(Bioneer，大田，韩国)生产(表1)。
为了经济用途，合成DNA用PCR法扩增。PCR使用合成DNA 2μl稀释至250pg/μl，正、反引物各10pmol, AccuPower®PCR主混合液10μl，其余用蒸馏水填充，终体积为20μl。使用Bio-Rad T100热循环(美国加州Bio-Rad实验室),混合物在95°C pre-denatured 5分钟,其次是30 94°C的周期30年代,55°C 30年代,1分钟和72°C,最终伸长步在72°C 5分钟。的扩增子受到在3%琼脂糖凝胶电泳50个基点DNA梯(达因生物、京畿道、韩国)和被证实和拍摄Doc XR +使用凝胶成像系统(美国加州Bio-Rad实验室)。
表1:合成DNA和引物的序列信息
合成DNA对NFBS的扩增与验证
为了选择合成DNA的浓度，当合成DNA与NFBS混合时，我们进行PCR验证合成DNA是否能成功扩增。140bp长的合成DNA被用于验证过程。建立最佳条件后，显示了90bp长的DNA的结果。在法医科学中使用NFBS时，需要大量的NFBS，为了节约资源，我们比较了以下两种条件的结果，选择了最佳浓度;(1）1ml NFBS加1μl合成DNA原液(稀释后估计浓度:50pg/μl)和（2）1ml NFBS加10μl合成DNA原液(稀释后估计浓度:500pg/ μl)。如上图所示，当NFBS未被稀释时，PCR成功;这让我们推测NFBS中存在PCR抑制剂。因此，我们决定通过稀释法建立PCR的最佳方案。实验按1:1、1:10、1:100、1:1000的比例稀释NFBS与合成DNA的混合物。
接下来，按照上述选择的1 ml NFBS与1μl合成DNA原液的比例1:1000进行稀释实验，以确定合成DNA的PCR反应。为了验证PCR扩增产物，将1ml NFBS与1μl合成DNA原液1000倍稀释后的混合溶液使用原引物进行扩增。扩增子在琼脂糖凝胶中电泳，然后用嵌套引物嵌套PCR进一步验证。用NFBS (S, Specific)扩增阳性对照组(PC)和DNA后，使用AccuPrep®PCR/凝胶DNA纯化试剂盒(Bioneer，大田，韩国)从琼脂糖凝胶中纯化DNA。然后用1:1000稀释的纯化DNA进行巢式PCR，前向引物同前，巢式引物如表1所示。合成DNA 90bp, 15pmol嵌套和向前引物，使用10μl AccuPower®PCR主混合液(Bioneer, Daejeon, Korea)，其余用蒸馏水填充，最终体积为20μl。对于长140bp的合成DNA，使用10pmol的嵌套前向引物和10μl的AccuPower®PCR主混合物，其余用蒸馏水填充，最终体积为20μl。
合成DNA的NFBS稳定性试验
为了验证合成DNA与NFBS混合的稳定性，将稀释1000倍的溶液在4℃室温下保存1 ~ 4周后进行PCR。我们先将含有合成DNA的NFBS按1:1000的比例稀释，然后将混合物置于4℃或室温下1 ~ 4周，然后用保存1、2、3、4周的溶液进行PCR，最后通过PCR验证合成DNA与NFBS混合的稳定性。
可识别NFBS的应用
首先，为了确认不同序列和长度的DNA是否可以被识别，我们将[14]中构建的长72bp的合成DNA与本研究中使用的合成DNA混合。如前所述，我们将NFBS与合成DNA的混合物按1:1000的比例稀释，然后确认PCR结果。接下来，为了验证本研究构建的长度为90bp和140bp的合成DNA以及前文研究中获得的长度为72bp的合成DNA是否可识别，我们将这三种合成DNA与NFBS混合，然后像上面一样稀释1/1000，观察PCR结果。最后,当负反馈(一)和负反馈(B)混合，我们想检查混合比例是否可以通过合成DNA在每个NFBS中的比例来估计。负反馈(一)和负反馈(B)制备两种NFBS，按1:1、2:1、1:5、5:1、2:1的比例混合制成混合样品，然后分别为90bp和140bp引物。浓度测定使用。
合成DNA的设计与合成
实验表明，合成的dna被成功扩增，扩增产物通过嵌套PCR得到确认。通过TA克隆过程的测序分析证实(图2)。此外，使用本研究设计的长为90bp、140bp的合成dna和引物集进行扩增，得到了预期大小的单个条带(90bp、72bp、140bp和122bp)。这一结果证实了合成的DNA可以被准确地扩增，并且在大量使用时可以经济地使用。
图2:合成DNA的扩增及用嵌套PCR和测序验证扩增产物。A:(A) 90bp， (b) 90bp -嵌套(72bp)， (c) 140bp， (d) 140bp -嵌套(122bp)， b: A的(A)和(c)测序结果(Top: 90bp, Under: 140bp)
合成DNA对NFBS的扩增与验证
浓度选择实验结果，结果显示在1ml NFBS +合成DNA混合物中PCR不成功，由此我们假设NFBS中存在PCR抑制剂。为了避免PCR抑制作用，我们将(a)和(c)稀释1000倍进行PCR。稀释溶液(b)和(d)都被扩增，由此我们假设稀释溶液不受NFBS中抑制剂的影响。由于(b)和(d)的扩增产物相似，为了节省资源，我们选择合成DNA浓度较低的(b)进行进一步的实验(图3-A)。
在选择最佳检测方法时，我们可以确认，如果不稀释NFBS和合成DNA的混合物，就不可能扩增，至少1:1稀释可以避免PCR抑制。此外，为了方便，我们可以将稀释因子提高(~ 1:1000)，因此我们进一步用1000倍的稀释倍数进行实验(图3-B)。
根据(图3-A和3-B)的结果，我们验证了NFBS +合成DNA (90bp)和NFBS +合成DNA (140bp)混合溶液的扩增产物。结果表明，PCR在两种混合物中都是成功的。同时，与阳性对照相比，我们可以从混合物中识别出一个相同大小的条带(图3-C)。这一结果表明，放大和大小识别都是可能的。我们可以进一步证实，无论本研究中使用的DNA大小如何，即使在低浓度下，合成DNA也能在NFBS中稳定检测到。
从凝胶(图3-C)中提取扩增子后，通过嵌套PCR对扩增子进行验证。结果表明，当使用与合成DNA不互补的嵌套引物时，扩增不成功。另一方面，当使用与合成DNA互补的引物时，扩增成功(图3-D)。由此，我们可以看出，两种不同合成DNA的识别是基于特异性结合到序列互补的DNA上的引物的特征(图3)。
图3:NFBS中合成DNA浓度的测定。(a) NFBS 1ml + DNA未稀释溶液1µl (b)稀释1ml NFBS + 1µl DNA未稀释溶液至1:1000©NFBS 1ml + DNA未稀释溶液10µl (d)稀释1ml NFBS + 10µl DNA未稀释溶液至1:1000。
图3 b:含合成DNA的NFBS PCR最佳检测方法的选择(a) NFBS 1ml + DNA原液1µl (b)将1ml NFBS + 1µl DNA原液稀释至1:1 (c)将1ml NFBS + 1µl DNA原液稀释至1:10 (d)将1ml NFBS + 1µl DNA原液稀释至1:10 (e)将1ml NFBS + 1µl DNA原液稀释至1:100。
图3 c:合成DNA NFBS PCR扩增产物的鉴定(A)合成DNA 90bp的NFBS (B)合成DNA 140bp的NFBS (A)，(e) 1/1000稀释的NFBS包括合成DNA (B)，(f)阳性对照(c)，(g) 1/1000不含DNA的NFBS (d)，(h) PCR空白。
图3:巢式PCR扩增产物验证。(A)含90bp合成DNA的NFBS (B)含140bp合成DNA的NFBS (A)，(f)非特异性嵌套PCR， (A) 90bp使用140bp嵌套引物(f) 140bp使用90bp嵌套引物(B)，(g)特异性嵌套PCR (c)，(h)阳性对照(d)，(i) 1/1000无DNA NFBS (e)，(j) PCR空白。
图3:合成DNA对NFBS的扩增与验证
合成DNA的NFBS稳定性试验
结果表明，NFBS中含有的合成DNA在4℃和室温下可以稳定1到4周(图4)。这意味着合成DNA在NFBS中是稳定的，即使混合物在4℃或室温下保存长达4周。
图4:在冷藏(4℃)和室温下进行1 - 4周稳定性试验。(A)冷藏(B)室温(A)，(e) 1周后PCR结果(B)，(f) 2周后PCR结果(c)，(g) 3周后PCR结果(d)， (h) 4周后PCR结果
可识别NFBS的应用
先前研究开发的含有合成DNA (72bp)的NFBS的实验结果表明，含有72bp长的合成DNA和NFBS的混合物可以通过1000倍稀释和一组与DNA互补的引物成功扩增(图5)。这意味着只有针对合成DNA序列的引物才能参与PCR，从而有可能将合成DNA与其他DNA区分开来(图5- a)。
接下来，在含有合成DNA (72bp, 90bp, 140bp)的NFBS鉴定实验中，在包括NFBS在内的1:1000稀释溶液中，对长度为72bp, 90bp和140bp的合成DNA进行鉴定(图5-B)。
最后，在实验中测定了NFBS的混合比(一)和负反馈(B)，混合了90bp和120bp的合成DNA，通过合成DNA在混合NFBS中的比例可以估计出1:1、1:2、1:5、5:1和2:1的混合比例(表2)(图6)。
图5:对已有研究开发的72bp合成DNA的NFBS应用(A)合成DNA NFBS PCR扩增产物的鉴定(B)巢式PCR扩增产物的验证(A) 1/1000稀释的NFBS包括合成DNA (B)阳性对照(c) 1/1000无DNA NFBS (d) PCR空白(e)非特异性嵌套PCR，使用140bp嵌套引物进行72bp (f)特异性嵌套PCR (g)阳性对照(h) 1/1000无DNA NFBS (i) PCR空白。
图5 b:确定三种NFBS，包括本研究中开发的合成DNA (a) 72bp (b) 90bp (c) 140bp。
图5:可识别NFBS的应用。
表2:两个NFBS混合应用程序
图6:两个NFBS测量混合比
在本研究中，当合成DNA与NFBS混合时，由于NFBS中PCR抑制剂的影响，合成DNA没有被扩增，但我们可以确认，通过至少1:1稀释，合成DNA可以在不受抑制剂影响的情况下顺利扩增。由于扩增产物经巢式PCR和测序验证，我们可以确认合成DNA混合NFBS使NFBS多样化，并可进行鉴定。此外，这些合成的DNA在4℃和室温下被稳定地扩增了4周，这表明当涉及到真正的双酚a时，在存储温度或货架寿命方面可以设想更广泛的使用。
使用合成DNA (90bp, 140bp)和之前研究中建议的72bp)制备了三种类型的NFBS。另外，通过定量分析合成DNA (90bp, 140bp)等两种NFBS混合后合成DNA量的比例，估计混合比例。通过这些，我们重建了一个大量人的血迹混合的出血部位，证实了BPA可能的应用。然而，当不同大小的合成DNA混合在一起时，需要确认它们是否可以正常使用，并在稳定性试验中验证更大范围的温度和湿度条件。此外，当合成DNA与未稀释的NFBS混合时，由于NFBS中的抑制剂，PCR无法进行，因此我们建议需要额外的实验来准确验证。
在这项研究中，我们能够通过将本研究中设计和生产的合成DNA添加到NFBS中，使强调现有物理特性的血液替代品多样化。通过这样做，我们可以提高NFBS的可用性，使其可以像从人类血液中进行DNA分析一样被识别出来。此外，我们相信，通过对混合血液中合成DNA的量化，估计血液的比例，可以得到BPA，通过这一点，将极大地有助于通过实验、研究和教育来破案，并进一步重建流血犯罪现场。
通过开发合适的血液替代物来替代人血，可以极大地帮助法医科学和血迹模式分析的发展。根据犯罪现场的BPA, DNA分析可以在更准确地重建多人血迹混合的犯罪现场的基础上，对破案有很大的帮助。一种开发的血液替代品[3]和合成DNA的组合测试不同的DNA序列或大小，通过多样化的分析结合已有的方法，以增加BPA的可用性，多样化和增加血液替代品的实用性，以增加BPA的研究和测试的可用性，并进一步帮助解决流血犯罪。
本研究得到了韩国国家研究财团(NRF)基础研究项目工程研究中心(ERC)的鉴定技术研发项目和科学调查项目的支持，并得到了韩国行政安全部(MOIS)国家鉴证院(NFS)的支持。
据我们所知，被点名的作者没有利益冲突，经济或其他方面。
引用:李相允，朴俊洙，李惠贤，徐永一，林时根，申世贤(2021)含DNA的法医血液代用品在血迹形态分析中的应用。法医腿部调查科学7:056。
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