肽LKEKK对角质形成细胞的抗炎作用

皮肤是哺乳动物最大的器官，有三大功能:保护、调节和感觉。哺乳动物的皮肤主要由两层组成:表皮和真皮层，前者在身体表面形成一层保护屏障，后者是皮肤附属物的位置。表皮是一种分层的鳞状上皮，由增殖的基底和分化的基底上角质形成细胞组成，这些角质形成细胞是表皮的主要细胞。表皮基底层的角质形成细胞增殖，子细胞向上移动，经历多个阶段的细胞分化，最终成为有核细胞。角质形成细胞对各种环境因素都有反应，在皮肤炎症的调节中起着至关重要的作用。角质形成细胞产生的五种促炎细胞因子已被证明参与了皮肤炎症的诱导:IL-17A, IL-22, oncostatin M, TNF-α和IL-1α[1]。单个细胞因子在皮肤炎症反应发展中的作用已经确定:IL-22和抑菌素M控制表皮增生和分化的丧失，而IL-1α， IL-17A和TNF-α提供先天免疫[2]的激活。

几年前我们合成了与胸腺素-α的16-20序列相对应的肽LKEKK (Np5)₁干扰素-α的131-135序列₂，能特异性结合人T和B淋巴细胞[3,4]，大鼠肠上皮细胞膜[5,6]，大鼠IEC-6[7,8]和人Caco-2[8]肠上皮细胞，小鼠Raw 264.7巨噬样细胞[9]。在所有情况下，蛋白酶处理不影响结合，表明肽受体的非蛋白性质。TM- α竞争性抑制Np5结合₁干扰素-α₂和霍乱毒素B亚基。我们认为该受体可能是毒素受体，即已知的GM1-glanglioside[10,11]。

最近我们发现Np5通过可溶性鸟苷环化酶依赖性信号通路[12]显著降低人Caco-2肠上皮细胞中TNF-α刺激的促炎细胞因子(IL-6、IL-8和IL-1β)的表达，并增加抗炎细胞因子IL-10的表达。此外，在右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型中，该肽(20 mg/kg体重口服14天)降低了TNF-α和IL-6的生成，以及炎症的严重程度。因此，Np5能够抑制炎症在体外而且在活的有机体内．

本研究的目的是研究Np5对正常人角质形成细胞的作用。

化学物质

人角质形成细胞培养基EpiGro来自Cell Applications, Inc.(美国)，IL-17A, TNF-a, IL-1a和其他化学物质来自Sigma(圣路易斯，密苏里州)。

肽

人类的胸腺素α₁和人类干扰素-α₂样本来自德国immundiagnostics AG公司。肽LKEKK (Np5)和KKEKL (iNp5)在应用生物系统模型430A自动合成器(美国)上合成，使用Boc/Bzl策略肽链延伸如上所述。在Delta Pack C18色谱柱上，100A (39×150 mm，网格尺寸5 mm;流速10 mL/min, 0.1% TFA洗脱，乙腈梯度10-40% 30 min)。肽的分子质量由快速原子轰击质谱分析(Finnigan质谱分析，圣何塞，加州)测定。氨基酸分析数据(6 M HCl水解，22h, 110℃;LKB 4151 Alpha Plus氨基酸分析仪，瑞典)和质谱分析如表1所示。

表1:多肽的主要特征。

角化细胞培养

正常人表皮角质形成细胞(NHEK)从Cell Applications, Inc.(美国)获得，在角质形成细胞无血清培养基EpiGro中培养24小时，EpiGro中含有未定义的EpiLife生长补充剂(美国赛默飞世尔科学公司)，5% CO₂培养箱在37°C，并用于第二或第三代。细胞用Np5或iNp5 (10-1000 nM)预处理1小时，然后用重组人IL-17A (20 ng/mL, 24 h)[13]刺激。

准备的^3.H] Np5

［^3.H]Np5是通过高温固相催化同位素交换[14]反应得到的。将氧化铝(50 g)加入免疫球蛋白(2 mg)或八肽(2 mg)水溶液(0.5 mL)中，在转子蒸发器上蒸发。应用肽的氧化铝与10毫克催化剂(5% Rh/Al)混合₂O_3.)．将得到的固体混合物置于10ml安瓿中。安瓿被抽出，在250 torr的压力下充满气态氚，加热到170°C，在这个温度下保持20分钟。然后，安瓿被冷却，抽真空，用氢气吹气，再次抽真空。用两份50%乙醇水溶液(各3ml)从固体反应混合物中提取标记肽，并将组合溶液蒸发。将不稳定氚重复两次去除。［^3.H]Np5在254和280 nm的Beckman分光光度计下，在Kromasil (4×150 mm;造粒5 mm, 20°C)。用0.1%的TFA洗脱，甲醇梯度42-70%，洗脱时间20 min;流速为3 mL/min。用液体闪烁计数法计算氚在肽中的掺入量。

结合试验

[的绑定]^3.在含10 mM Hepes, 20 mM NaN的1 mL角质形成细胞无血清培养基EpiGro中测定H]Np5对细胞的影响_3.0.6 mg/mL PMSF (pH 7.4): 100 μl标记肽(浓度范围10^－10－10⁷M，每个浓度点三份)加100 μl培养基(用于总结合)或10⁴将M个未标记肽(用于非特异性结合)加入800 μl的细胞悬液(10⁶4℃孵育30分钟。然后用Whatman GF/A玻璃纤维过滤器过滤样品，分离细胞结合的标记蛋白和非结合(游离)蛋白。滤镜用5ml冰镇盐水冲洗三次。使用Mini-Gamma计数器(LKB，瑞典)计算放射性。标记肽与细胞的特异性结合被确定为总结合和非特异性结合之间的差异，在存在10⁴M标记肽。[的特定绑定^3.H]Np5对细胞的作用进一步由平衡解离常数表征K_d,以确定K_d，结合(B)和游离(F)标记蛋白的摩尔浓度之比与结合标记蛋白(B)[15]的摩尔浓度之比。

竞争分析

目的:评价TM-α的抑制作用₁干扰素-α₂iNp5，细胞(10⁶/mL)与5 nM标记肽和其中一种被测配体(浓度范围为10^{-12 -}10⁵M;每种浓度三次测量)如上所述。抑制常数(K_我)的计算公式为:K_我= (集成电路₅₀) / (1 + [L] /K_d)[16]，其中[L]为标记肽摩尔浓度;K_d为标记肽受体复合物的平衡解离常数;集成电路₅₀是未标记配体的浓度导致50%的抑制标记肽特异性结合。集成电路₅₀从抑制图中图解确定。的价值K_d如上所述确定。数据被表示为平均值±SEM至少三个独立的实验。

测量可溶性(sGC)和颗粒(pGC)鸟苷环化酶活性

如前所述，在4°C条件下从人角质形成细胞中获得亚细胞组分[8]。通过监测[α-]的转化，测定鸟苷酸环化酶(sGC和pGC)活性³²P]三磷酸鸟苷(³²P] cGMP [17];产物经碳酸锌沉淀和氧化铝[18]柱层析分离得到。酶活性以10分钟内产生的cGMP量表示(单位为每1毫克蛋白质的纳摩尔)。以牛血清白蛋白为标准，用Lowry法测定蛋白浓度。为了抑制sGC的活性，使用ODQ (1H-[1,2,4]恶二唑洛[4,3-α]喹啉-1-酮的抑制剂[19]在5-100 μM的浓度范围内。

细胞因子elisa

为了测量角质形成细胞中细胞因子的浓度，使用POLYTRON®PT 1200 E (Kinematica AG)将细胞均质于含1 mM PMSF、10 μg/mL抑肽蛋白、10 μg/mL leupeptin和10 μg/mL pepstatatin A (Sigma-Aldrich)的三体积冰冷PBS中。(瑞士)，并在12000 ×g在4°C下离心10分钟。以牛血清白蛋白为标准，用Lowry法[20]测定蛋白浓度。用ELISA法测定。结果以细胞因子量/总蛋白浓度表示。根据制造商的说明(BD Biosciences, San Jose, CA)进行elisa。数据以平均值±SEM表示(图1)。

图1:健康和发炎皮肤的成分。(a)表皮是由角化细胞缓慢分化形成的。在颗粒层角质形成细胞中，抗菌肽(amp)可能被储存，包括S100A7, S100A8, S100A9， β-防御素，抗菌肽(CAMP/LL-37)和脂脂素2 (LCN2)。当颗粒状角质形成细胞转变为角质细胞时，细胞核消失，形成交联的蛋白膜结构，称为角化包膜，其之间沉积了许多层中性脂质。这就产生了一个有效的不透水的屏障。表皮含有未成熟抗原提呈细胞朗格汉斯细胞(LCs)，真皮含有常驻髓样树突状细胞(dc)。虽然皮肤中存在非再循环皮肤淋巴细胞抗原(CLA)常驻记忆T细胞(Trm细胞)，但角质形成细胞组成合成CCL27 (CTACK)，这是吸引CCR10 CLA皮肤归母T细胞进入非炎症皮肤进行免疫监视的主要趋化因子。这些成分维持皮肤免疫的稳定状态或有效的耐受状态。(b)表皮也可参与先天或适应性免疫反应，如损伤、感染或细胞因子刺激。角质形成细胞可能(1)在IL-22等细胞因子的作用下增殖，以加速表面角质形成细胞的损失并消除病原体，(2)增加先天效应分子的合成，如AMPs，(3)通过产生趋化因子，新的T细胞亚群和其他免疫效应细胞直接迁移到皮肤中。 (Additional abbreviations used in figure: IFN-α, interferon-α; TNF, tumor necrosis factor; TSLP, thymic stromal lymphopoietin; T17, IL-17-producing CD4 and CD8 T cells; Th, T helper cells.).

数据以均数±SEM表示。学生的t-test仅在两组之间进行比较时使用。当p < 0.05时，认为差异显著。

合成肽的主要特征(纯度、氨基酸含量和分子质量)如表1所示。HSCIE反应与随后的肽纯化得到[^3.H]Np5，比活性28 Ci/mmol。在Kromasil C18柱上，标记肽和未标记肽的保留时间为11分钟(见“材料和方法”);标记肽和未标记肽的254/280 nm吸光度比相同，证实氚取代氢不影响肽的化学结构。

绑定的^3.Np5到人角质形成细胞

实验表明[^3.H]Np5与细胞特异性结合，这种结合是可逆的和饱和的;系统标记肽受体的动态平衡大约在30分钟后建立，并在此状态保持至少1小时。因此，评估平衡解离常数(K_d)，反应持续30分钟。[的非特异性结合^3.H]Np5在此条件下占总结合量的12.6±0.3%。[的具体绑定分析^3.H]Np5到细胞的Scatchard坐标(图2)表明，在细胞表面有一类肽的结合位点(受体):图表示一条直线。的K_d当值为2.6±0.2 nM时，表明标记肽对受体具有较高的亲和力。

图2:[特异性结合的Scatchard分析^3.Np5到人角质形成细胞。B和F -结合肽和自由标记肽的摩尔浓度。

描述[的特异性^3.H]Np5与细胞结合，未标记TM-α₁干扰素-α₂， Np5和具有反向KKEKL序列的肽iNp5作为潜在的竞争对手进行测试。的K_我值(表2)显示TM-α具有较强的抑制能力₁干扰素-α₂，而iNp5没有抑制标记肽的结合(K_我>10 μM)，说明TM-α特异性高₁干扰素-α₂、iNp5绑定。因此,TM -α₁干扰素-α₂， Np5与正常人角质形成细胞上的共同受体具有高亲和力和特异性。

表2:抑制(^3.Np5通过未标记的配体与人角质形成细胞特异性结合。

*值为两个独立实验的平均值±SEM，每个实验重复3次。

Np5对人角质形成细胞的sGC和pGC活性

表3的结果表明，Np5在50 ~ 1000 nM浓度下以剂量依赖性的方式增加细胞中的sGC活性，但不影响pGC活性;并行测试的iNp5无效。因此，Np5对sGC的激活作用具有特异性和剂量依赖性(表3)。

表3:Np5和iNp5对人角质形成细胞sGC和pGC活性的影响。

^＊经验与对照之间有显著差异(P< 0.05)。

Np5效果人角质形成细胞il - 17a诱导的细胞因子分泌的影响

表4的结果显示，与单独使用IL-17A处理的细胞相比，使用Np5(浓度范围为50-1000 nM)预处理的细胞显著减少了TNF-α、IL-6和IL-1α的生成。氨基酸序列颠倒的肽iNp5不活跃;这表明Np5作用具有高度特异性。因此，Np5减少了促炎细胞因子的产生在体外．表5中的数据显示，Np5预处理细胞后，抗炎细胞因子IL-10的分泌显著增加。并行测试iNp5是不活跃的。因此，Np5增加了抗炎细胞因子IL-10的分泌在体外．

ODQ对Np5抑制人角质形成细胞il - 17a诱导的细胞因子分泌的影响

表6的数据显示，可溶性鸟苷酸环化酶[19]的抑制剂ODQ以剂量依赖性的方式抑制sGC活性，以及500 nM Np5对il - 17a诱导的人角质形成细胞分泌TNF-α和IL-1α的抑制作用。因此，抑制sGC活性会导致Np5抑制细胞产生促炎细胞因子的能力的丧失体外。

筛选36种细胞因子的活性发现5种促炎细胞因子- IL-17A, IL-22, IL-20, IL-6, IL-8，在costatin M (OSM)， TNF-α， IL-1α， IL-1β上作为皮肤炎症的有效诱导因子，其中IL-1a, IL-17A和TNF-a表现出最高的活性[1]。一年前，我们在肿瘤坏死因子诱导的人Caco-2肠上皮细胞炎症模型中证明了Np5的抗炎活性在体外在右旋糖酐硫酸钠引起结肠炎的小鼠模型中在活的有机体内[8]。在本研究中，我们检测了Np5的抗炎潜力在体外il - 17a诱导的正常人角质形成细胞炎症模型。为此，用10-1000 nM浓度范围内的肽处理细胞，加入IL-17A (20 ng/mL)诱导炎症反应。同时，将iNp5氨基酸序列颠倒的肽作为阴性对照。我们的实验表明，在50-1000 nM浓度下用Np5预处理角质形成细胞后，il - 17a诱导的三种主要促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1α)的分泌呈剂量依赖性显著减少(表4)，同时增强抗炎因子Il-10的分泌(表5)。这表明Np5作用具有高度特异性。

表4:用Np5和iNp5预处理人角质形成细胞对il - 17a诱导的促炎细胞因子分泌的影响。

*经验组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。

表5:Np5和iNp5预处理人角质形成细胞对il - 17a诱导的抗炎细胞因子IL-10分泌的影响。

*经验组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。

我们最近发现Np5对各种类型细胞(人T和B淋巴细胞，人Caco-2和大鼠IEC-6肠上皮细胞，小鼠Raw 264.7巨噬细胞样细胞)的作用是通过cmp依赖通路介导的[4,8,9]。本研究结果表明Np5与人角质形成细胞具有高亲和力结合(K_d2.6 nM)，并以剂量依赖性的方式增加sGC活性(表3)。我们在这里研究了在部分或完全缺乏sGC活性的情况下，该肽对角质形成细胞il - 17a诱导的TNF-α和IL-1α分泌能力的影响。抑制酶活性是通过使用sGC ODQ的抑制剂来实现的，该抑制剂氧化NO结合[19]的血红素假体基团。研究发现，酶活性的降低伴随着肽抑制细胞因子分泌能力的丧失(表6)。因此，Np5通过sGC减少il - 17a刺激的人角质形成细胞中促炎细胞因子的分泌。

表6:ODQ对500 nM Np5预处理人角质形成细胞sGC活性和il - 17a诱导的细胞因子分泌的影响

*经验与对照之间有显著差异(P< 0.05)。

Np5 (LKEKK)与人角质形成细胞结合具有高度特异性和亲和力，降低其对il - 17a诱导的促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1α)分泌的能力，并增加其抗炎细胞因子IL-10的分泌。值得注意的是，Np5是一种结构简单的短肽，具有作为抗炎药物的巨大潜力。

没有任何利益冲突可以被视为损害研究报告的公正性。

本研究由RAS委员会基础研究项目“分子与细胞生物学”资助(no . 0101-2014-0086)。

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