一种新的食物增效助剂-抗氧化分析和细胞生物学研究

膳食补充剂是一种口服的产品，含有一种或多种成分，如维生素、矿物质、草药或氨基酸，旨在补充人们的饮食，不被认为是食物。在过去的30年里，成年人对膳食补充剂的使用不仅在美国，而且在世界上许多高度工业化的国家也有增加[1-3]。目前，大约一半的美国成年人报告说他们使用一种或多种膳食补充剂。补充剂的使用与改善健康状况和生活方式的选择有关[4]。运动员将膳食补充剂作为他们常规训练或比赛计划的一部分。许多有益的健康效果也被描述为膳食补充剂在氧化应激的情况下[6-8]。

营养研究的最新领域是食物协同研究，它起源于美国。与以往从食物中分离单个活性物质并检查其对我们身体影响的医学研究方法不同，食物协同作用研究已经在其复杂的自然形式和组成中调查了食物的实体约20年。研究的目的是检验食物中的植物化学物质以及维生素、矿物质和微量元素是如何共同作用的[9-13]。新型食物协同增效剂就是基于这一知识，结合了尽可能多的天然维生素、矿物质和微量元素，以促进协同效应。

在本研究中，我们使用电流在体外研究食物增效助推剂在抗氧化功效和刺激基底细胞代谢方面的有益作用。这两种特征相辅相成，因为细胞代谢的增加也会通过线粒体呼吸链产生更多的内源性超氧阴离子自由基。

食品协同助推器

根据食品增效助推器制造商和分销商的信息(Millivital GmbH, D-55232阿尔泽，德国;主页:www.millivital.de)，“这种活性成分的复杂混合物中的植物化学物质是真正的力量组合”。它含有27种不同的浓缩果汁，7种不同的蔬菜汁，39种不同的草药提取物和维生素C[14,15]。活性成分的选择以协同的方式作用，以产生最佳的生物利用度和功效。液体食品增效助推剂，批号为。L13003209在本研究中进行了检测，有效期为2021年9月30日。

每日推荐摄入量和测试浓度

建议成年人每天摄取9毫升纯食物增效剂或混合水。在体力增加的时候，每日剂量可以增加到9毫升，一天两次。考虑到每日摄取以及3.5升血液中活性成分(理论上)的完全吸收和分布，计算出的测试浓度在2.5至5 mg/ml之间。尽管活性成分的生物利用度可能有所不同，但我们在细胞生物学实验中使用的测试浓度覆盖了这个范围。

光化学发光法测定抗氧化能力

该方法使用了PHOTOCHEM®(Analytik Jena, D-07745 Jena, Germany)，它结合了自由基形成的非常快速的光化学激发和高灵敏度的光度检测。可以测量单个物质和复合物质混合物的抗氧化能力，从而测定它们灭活游离氧自由基的能力。

基本上，测量方法的要点在于氧化反应速度比正常情况快1000倍，这是由反应分子的光化学激发引起的。在使用特定染料的测量系统中产生确定的自由超氧阴离子自由基。通过与化学发光物质的反应和测量产生的光子来检测自由基。在抗氧化物质存在的情况下，光化学发光强度随浓度的不同而减弱。水溶性抗氧化剂与脂溶性抗氧化剂分别测定和定量。对于水溶性物质[16]，以抗坏血酸等量浓度单位给出结果，对于脂溶性物质，以维生素E等量物(Trolox®)给出结果[17,18]。

结缔组织成纤维细胞的基础能量代谢

实验采用结缔组织成纤维细胞(细胞系L-929, ac -2;莱布尼茨研究所DSMZ -德国微生物和细胞培养集，布劳恩施威格，德国)和使用在第109至110段。细胞在含有10%生长混合物和0.5%庆大霉素的RPMI 1640培养基中常规培养，37温培养箱中培养^°C和5% CO的气氛₂95%的空气，几乎100%的湿度。

实验中，结缔组织成纤维细胞在96孔板(200 μ l培养基/孔)中以2万个细胞/孔的细胞密度以80 ~ 90%的融合量培养方式接种，培养24 h以实现细胞附着和代谢。然后，除去培养液，反应混合物由磷酸盐缓冲盐水和钙、镁、5mm葡萄糖、不同测试浓度的食品协同增效剂和四唑染料WST-1(罗氏诊断公司，德国曼海姆)组成。染料的裂解与基础细胞代谢的活性直接相关，这也包括在线粒体中产生三磷酸腺苷。用Elisareader (BioTek SLx808，软件Gen 5 Version 3.00)连续记录光密度，作为微分波长测量ΔOD = 450 - 690 nm，用Microsoft Excel分析时间间隔为0 - 120分钟。本研究进行了三个平行实验。

功能性中性粒细胞产生内源性氧自由基

人早幼粒细胞(细胞系HL-60, ACC-3, ECACC 98070106;莱布尼茨研究所DSMZ -德国微生物和细胞培养集，布劳恩施威格，德国)常规生长在RPMI 1640中，加入10%的生长混合物和0.5%的庆大霉素，37孵育^°C在5% CO的潮湿气氛中₂和95%的空气。在培养基中加入1.5%的二甲基亚砜，培养6 d后，继代培养基分化为功能性中性粒细胞。然后，细胞能够在phorbol酯刺激下经历氧化或呼吸爆发[19,20]。

6天后，细胞以离心(190xg 5分钟)收集，用磷酸盐缓冲盐水重悬离心洗涤两次，最后在含10 mM葡萄糖的钙镁磷酸盐缓冲盐水中重悬。将细胞悬浮液添加到由不同浓度的Food Synergy Booster、含30 mM葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水、phorbol 12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐和作为四唑染料的WST-1组成的反应混合物中(均来自德国Deisenhofen的Sigma-Aldrich)。如前所述，受刺激的功能性中性粒细胞产生的超氧阴离子自由基失活过程通过染料的裂解来监测[21-24]。光密度在450 - 690 nm处的微分测量，在37^°C使用BioTek ELx 808 ELISA阅读器，软件Gen 5 Version 3.00。本研究进行了三个平行实验。

细胞生物学数据采用无参数双侧Wilcoxon-Mann-Whitney检验进行统计分析，并假设在p≤0.05时显著。

根据生产厂家的说明，Food Synergy Booster具有显著的总抗氧化能力，水溶性抗氧化剂约为50%，脂溶性抗氧化剂约为50%(表1)，总抗氧化能力超过38300 μ mol/100 g。作为比较，在相同的实验条件下，获得了以下总抗氧化能力值(每mol/100 g):姜- 28000;马郁兰- 9100;红辣椒粉- 4200。

表1:介绍食物增效助推剂的总抗氧化能力。注意，大约50%的总抗氧化能力来自于水溶性抗氧化剂，其余50%来自于脂溶性抗氧化剂。

结缔组织成纤维细胞基底细胞代谢的检查表明，在反应混合物中添加食物协同助推剂，在测试浓度≥2.5 mg/ml时，细胞代谢会迅速显著增加(图1)。最高测试浓度为5 mg/ml时，最大刺激是控制值的倍数。这种效果在使用食物增效剂几分钟后就开始了，在20到30分钟的时间范围内达到了最大值。此后刺激逐渐减弱;但在90分钟和120分钟后仍高于对照值。在10到30分钟的时间范围内，两种最高检测浓度与对照值的差异非常显著(p≤0.01)。对于5 mg/ml的最高测试浓度，在120分钟内的所有时间值都与对照有显著差异。

如图2所示，细胞氧化爆发产生的超氧阴离子自由基的活性呈剂量依赖性下降。即使在最低浓度为0.1 mg/ml的Food Synergy Booster的测试下，自由基活性的降低也有统计学意义(p≤0.05)。当试验浓度为2.5 mg/ml(相当于单剂量的Food Synergy Booster)时，自由基活性降低了近35% (p≤0.01)。自由基活性在最高试验浓度5 mg/ml(相当于每天两次单次剂量)时的最大降幅超过60%。

图1:在反应混合物中应用不同浓度的食物协同增效剂后，培养结缔组织细胞基础代谢随时间的增加。对照组(试验浓度为0 mg/ml)设为0%。单剂量的食品协同增效剂对应的测试浓度为2.5 mg/ml，假设吸收为100%。数据为3次平行实验的平均值±标准差。

图2:给出了反应混合物中超氧阴离子自由基活性的测量数据。对照组(试验浓度为0 mg/ml)设为100%。超氧阴离子自由基活性明显呈剂量依赖性下降。单剂量的食品协同增效剂对应的测试浓度为2.5 mg/ml。为了更好地可视化食品协同增效剂的剂量依赖性功效，计算的线性回归也被描述。数据为3次平行实验的平均值±标准差。

多年来，众所周知，线粒体在细胞的能量代谢中发挥着核心作用，因为它们将食物氧化产生的一部分能量转化为三磷酸腺苷。在这里测试的膳食补充剂对细胞代谢有如此显著的功效在体外还应该提高身体表现吗在活的有机体内．这就是为什么它被称为食物协同助推器的一个原因。然而，细胞代谢的增加和线粒体呼吸链产生三磷酸腺苷的增加也会产生更多的内源性超氧阴离子自由基，这是其他高活性氧物种的前体，如过氧化氢和羟基自由基[25]。

活性氧是人体内自然产生的化合物。它们可能具有积极作用(如对免疫系统)，也可能具有消极作用(如脂质、蛋白质或DNA氧化和损伤)[26-29]。为了限制这些不需要的和有害的影响，生物体有自己的抗氧化系统。该系统由抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和各种维生素[30]等非酶抗氧化剂组成。内源性自由基生成和抗氧化防御之间的不平衡导致氧化应激，氧化应激可能与衰老和许多病理过程有关[31-33]。

灭活内源性产生的超氧阴离子自由基是食品协同增效剂的第二个目标。一方面，它能够非常有效地增加细胞代谢，另一方面，它含有植物化学物质和维生素C的成分，具有协同作用，能够灭活由此产生的血液中循环的过量活性氧自由基[34,35]。但是，我们的测试结果不能回答是细胞产生的超氧阴离子自由基被抑制了，还是被释放到反应混合物中的自由基失活增加了。尽管如此，超氧阴离子自由基浓度得到了有效的降低。膳食补充剂的水溶性和脂溶性抗氧化剂的总抗氧化能力也证明了这种效果。除此之外，吞噬细胞，如多形核中性粒细胞，能够从血液迁移到组织中，并在炎症过程中产生局部过量的活性氧自由基[31,36]。

总之，在本研究中测试的食物协同增效剂已经清楚地证明了其在应用后立即增加结缔组织成纤维细胞基础能量代谢的潜力。此外，它的总抗氧化能力和灭活内源性活性氧的潜力非常突出，有助于减少氧化应激。根据我们的测试结果，食物协同助推器的有效成分的协同组合可以被推荐来改善和维持身体表现和健康在活的有机体内．