目的:寨卡病毒(ZIKV)是黄病毒科的一员,在泰国和国外与严重的先天性和神经病理异常有关。尽管不同的机构正在研制几种疫苗,但还没有获得批准的预防人感染寨卡病毒的疫苗。
方法:在这种背景下,疫苗开发的需求,我们的研究基于使用亚洲菌株SV0010-15的寨卡灭活疫苗临床前阶段的开发。采用世卫组织的Vero细胞(RCB 10-87)和福尔马林灭活血清培养基(VP-SFM),按照世卫组织的建议和质量控制生产寨卡灭活疫苗。临床前模型采用小动物研究免疫反应、安全性和剂量制定,随后采用非人灵长类动物模型研究疫苗疗效。
结果:结果表明,两剂注射可获得最佳的寨卡疫苗/明矾佐剂剂量配方(5µg/250µg)。此外,在非人类灵长类动物中,它被证明是安全的,具有免疫原性,并对两种寨卡病毒基因型具有保护作用。最终,根据世卫组织的指导方针,该候选疫苗开发的第一步已经成功完成,并表明该产品可以在卫生当局的要求下,以GMP试点规模开发临床阶段。
灭活疫苗;泰国;疫苗;Zika病毒疫苗;Zika病毒
寨卡病毒(ZIKV)是一种蚊媒病毒,属于黄病毒科和黄病毒属,其中包括几种人类致病性黄病毒,如日本脑炎病毒(JEV)、登革病毒(DENV)。寨卡病毒是一种虫媒病毒,主要由伊蚊传播,包括埃及伊蚊而且白纹伊蚊.这些蚊子种类在热带和亚热带地区的地理分布导致了几次暴发,包括最近在巴西的大流行,随后是太平洋岛屿和北美和南美其他地区[1]。今天,寨卡病毒在全球广泛传播。ZIKV于1947年首次从乌干达森林中的一只哨猴身上发现并分离出来,于2015年12月成为一种全球健康威胁。在过去70年里,寨卡病毒对全球公共卫生系统的影响有限,而东南亚和非洲报告的人间病例很少。直到2007年寨卡病毒才引起大规模暴发,并首次在亚洲和非洲以外发现。此外,寨卡病毒在大洋洲形成威胁,2013-2014年法属波利尼西亚爆发了大规模疫情。自2015年以来,寨卡病毒在巴西流行,致病性增加,影响神经系统,导致严重的先天性畸形(小头畸形)和神经系统如Guillain-Barré综合征(GBS)伴急性炎性脱髓鞘神经病变[5-7]。在2月1日圣2016年,世卫组织宣布巴西寨卡病毒流行为国际关注的突发公共卫生事件。在泰国,关于寨卡病毒可能存在的第一份报告记录于1963年[8]。2013年初,在旅行者中也发现了寨卡病毒,最近还观察到几例本地病例,这证明寨卡病毒在泰国普遍存在[9-10]。2018年,英国卫生当局(英国公共卫生部(PHE)已将泰国列为寨卡病毒传播风险国)。
现已研制出几种寨卡病毒疫苗候选疫苗,并在临床前和临床试验中进行了测试。这包括核酸疫苗(DNA和RNA疫苗)、灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒载体疫苗、表达系统纯化蛋白或病毒样颗粒[11]形式的蛋白抗原疫苗。2016年中期,世卫组织、儿基会和一个独立主题问题专家工作组提出了寨卡病毒疫苗目标产品概况(TPP),供在紧急情况下使用(即在流行地区怀孕期间的紧急需要),或在未来即将爆发疫情的情况下使用。TPP建议非复制平台,如灭活的全病毒粒子和亚基基,以及使用明矾作为佐剂的平台。提出的TPP模型是用灭活的寨卡疫苗激发ZIKV包膜特异性中和抗体,并保护非人灵长类动物(NHP)免受来自巴西和波多黎各[12]病毒株的挑战。2017年9月,泰国玛希多大学分子生物科学研究所疫苗开发中心(CVD)、政府制药组织(GPO)和国家疫苗研究所(NVI)公共卫生部接受了挑战,决定在泰国开发一种灭活寨卡疫苗。2017年9月,三方签署了一份谅解备忘录(MOU),按照TPP的建议,使用世卫组织的Vero细胞开发这种灭活寨卡疫苗。目前的研究报告是关于在泰国开发这种寨卡病毒疫苗的临床前阶段。
细胞
WHO Vero细胞RCB 10-87来源于GMP细胞库产品,该产品在政府制药组织(GPO)制备并广泛鉴定。
Zika病毒株
采用寨卡病毒SV0010/15感染株制备候选灭活疫苗(GenBank: KX051562.1)。ZIKV SV0010/15由泰国公共卫生部疾病控制流行病学司慷慨提供。用超烧瓶(Corning, Corning, NY)在WHO Vero细胞中扩增ZIKV SV0010/15,接种后第4天和第6天收获。病毒滴度测试7 log10斑块形成单位/毫升,证实无支原体。通过直接PCR扩增子基因组RNA测序证实了寨卡病毒的身份。采用zkv病毒株MR766(非洲株)进行灵长类动物异源zkv挑战。灭活寨卡病毒候选疫苗株SV0010/15是在Mahidol大学分子生物科学研究所疫苗开发中心的病毒疫苗洁净室设施内生产的。WHO Vero细胞在超烧瓶(康宁;)中进行了放大。采用无血清培养基(VP-SFM, Gibco)接种Vero细胞,标准MOI为0.01 PFU/细胞。在第4天和第6天收集病毒。收集的病毒通过冷藏离心5000转约10分钟澄清,使用Sartopure 0.45 μ μ PP3 (Sartorius)过滤0.45微米,通过切向流过滤(TFF) pelicon 2迷你过滤器超滤500 Kda(默克微孔)浓缩。使用核酸酶消化(苯并酶内切酶,默克)去除残留的Vero细胞DNA,并在Capto Core 700 (GE Healthcare Life Sciences, pittsburgh, USA)柱上纯化病毒悬液。按照前面描述的方法[13],用0.05%的福尔马林在22°C下灭活ZIKV 7天。 Formalin was removed by diafiltration 100 Kda (Merck millipore). Ultimately, the antigen concentration was adjusted with a 6% sucrose, PBS pH 7.4 buffer. Inactivation was considered as complete when no infectious particle could be detected by Indirect Fluorescent after three serial amplifications of the sample in vitro in C6/36 for 7 days. Quality controls were applied accordingly to the Requirements for Japanese Encephalitis Vaccine (Inactivated) for Human Use as previously described [14].
小型哺乳动物的临床前免疫原性
免疫反应的临床前阶段在Mahidol大学兽医科学学院的动物设施在Balb/c小鼠中进行。Balb/c雌性小鼠6-8周龄购自泰国M-CLEA Bioresource公司。每组6只,随机分为不同组。以100μl的剂量(第0天和第14天)通过IM途径接种5μg疫苗和10μg佐剂(2% Alhydrogel, Invivogen)。第2次给药后第35天,心脏穿刺[15]采集所有小鼠血液。
灵长类动物的临床前免疫原性
两组9(9)只4-5岁食蟹猕猴(猕猴属fascicularis),来自泰国萨拉武里省朱拉隆功大学国家灵长类动物中心的动物设施,接种疫苗包括:第一组(n=6),接受5 μg灭活寨卡疫苗和佐剂(2% Alhydrogel, Invivogen)的强化剂量(第0,14天);第二组(n=3)作为阴性对照。所有标本均只注射佐剂和PBS7.4,以100 μl体积疫苗随机注射。于第一次注射后第0、7、14、21、30、60天采血。
道德
所有小型哺乳动物模型的动物实验方案都得到了Mahidol大学兽医科学学院动物护理和使用委员会(COA)的批准。没有:muvs - 2017 - 12 - 56)。灵长类动物临床前免疫原性的动物实验方案得到朱拉隆功大学动物护理和使用委员会(COA)的批准。没有:2075002)。
猴子挑战试验
第180天,第1组食蟹猕猴被分为2个亚组:第1亚组(1/1 ~ 1/3)被ZIKV菌株SV0010/15(亚洲株,效价5.7 log10)挑战,第2亚组(1/4 ~ 1/6)被ZIKV菌株MR766(非洲株,效价5.7 log10)挑战。两种药物均经皮下注射约0.5 ml。
第二组为阳性对照(ⅲ组)(2/1 ~ 2/3)。zkv菌株SV0010/15以相同剂量(0.5 ml 5.7 log10滴度)攻毒。按照先前建立的方案[12],从第180天到第187天,每天采集血液样本。
ELISA (IgG)血清学检测
简单地说,我们使用的是fbs耗尽的ZIKV抗原株MR766,如前所述,它来自于Vero细胞,已经从所述的使用黄病毒小鼠大脑抗原的技术进行了轻微调整,并被使用寨卡病毒细胞培养抗原[16]所取代。
ELISA (IgM)血清学试验
如前所述,ZIKV特异性捕获IgM采用改良ELISA法[17-18]。
ELISA光学阅读价值
每个样品的光密度读数(OD)值的比值(P/N)为阳性对照血清,包括样品孔值除以阴性对照血清孔值。用于ELISA检测IgG和IgM。因此,当P/N≥2或样品OD高于阴性对照OD约2倍[18]时,认为样品为阳性。
血小板减少中和试验(PRNT50)
简单地说,我们使用ZIKV毒株SV0010/15(亚洲毒株)和MR 766(非洲毒株)分别按照前面描述的[19]方案中和同源和异源抗体。
rt - pcr
[20]之后,我们使用Uni的外部引物对(5 ')1171TGGGGNAAYSRNTGYGGNYTNTTYGG11973 ')和Unirev (5 '2178CCNCCHRNNGANCCRAARTCCCA21553 '),其次是内侧的Mounifor2 (5 ')1209GGRDRMDTBKWSAYVTGYGCNAWRTT12353 ')和Mounirev2 (5 ')2094CCNATNSWRCTHCCHKHYYTRWRCCA20683 ')。扩增过程如下:50°C 30 min, 95°C 2 min, 95°C 20s, 55°C 20s, 68°C 30s, 1个循环。
病毒分离
C6/36细胞被用于病毒分离和间接荧光(IFA)鉴定,如前所述[21]。
空斑实验
用Vero细胞单层膜进行空斑法病毒滴定。计数斑块,计算病毒滴度,并以PFU/ml[19]表示。
集团(1) |
疫苗/明矾(配方) |
几何平均滴度(GMT)(2) |
|
一天0 |
35天 |
||
一个 |
5/100 |
<10(3)/ < 10(4) |
205/131 |
B |
5/250 |
< 10 / < 10 |
638/923 |
表1灭活疫苗SV0010/15株在Balb/C小鼠中的免疫原性(PRNT50)
传说:(1)=小鼠组;
(2)=几何平均滴度(GMT)为6只小鼠中和抗体计算的平均值;
(3)=寨卡病毒SV0010/15株(同源株)中和;
(4)=被寨卡病毒MR766株(异源株)中和
兹卡灭活疫苗株SV0010/15在Balb/c小鼠中被证明是安全的和免疫原性的。此外,寨卡疫苗/明矾(5µg /250µg)的剂量配方对寨卡病毒基因型产生了可变的免疫原性(表1)。
6只食蟹猕猴接种两剂寨卡疫苗/明矾后未观察到局部或全身反应。大多数猴子在第14天的ELISA中IgM和IgG均呈高阳性(图1)。
时间(接种后日) |
||||||||||||||||||||
免疫组(1) |
猴子 |
阴性对照组(2) |
||||||||||||||||||
1/1 |
1/2 |
1/3 |
1/4 |
1/5 |
1/6 |
2/1 |
2/2 |
2/3 |
||||||||||||
IgM |
免疫球蛋白 |
IgM |
免疫球蛋白 |
IgM |
免疫球蛋白 |
IgM |
免疫球蛋白 |
IgM |
免疫球蛋白 |
IgM |
免疫球蛋白 |
IgM |
免疫球蛋白 |
免疫球蛋白 |
免疫球蛋白 |
免疫球蛋白 |
免疫球蛋白 |
|||
0 |
0(3) |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||
7 |
0 |
0 |
2.3 |
0 |
2.4 |
0 |
0 |
0 |
3.4 |
0 |
2.7 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||
14 |
2.5 |
2.5 |
11.6 |
3.7 |
18.3 |
5.1 |
5.0 |
4.8 |
30. |
3.4 |
22.2 |
3.1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
||
30. |
0 |
2.2 |
5.8 |
3.1 |
9.7 |
5.0 |
2.6 |
5.3 |
18.1 |
3.3 |
16.8 |
3.9 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
图1:ELISA检测与寨卡疫苗灭活株ZIKV SV0010/15免疫的食蟹猕猴反应抗体
时间(接种后日) |
猴子 |
|||||||||||||||||
免疫组(1) |
阴性对照组(2) |
|||||||||||||||||
1/1 |
1/2 |
1/3 |
1/4 |
1/5 |
1/6 |
2/1 |
2/2 |
2/3 |
||||||||||
Z1(3) |
Z2(4) |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
Z1 |
Z2 |
|
0 |
<10(5) |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
60 |
11 |
18 |
273 |
320 |
12 |
20. |
91 |
149 |
26 |
33 |
10 |
21 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
180 |
16 |
<10 |
244 |
172 |
18 |
<10 |
87 |
120 |
12 |
24 |
20. |
13 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
<10 |
图2:通过斑块减少中和试验(PRNT50)研究灭活疫苗(寨卡病毒株SV0010/15)在猴体内的免疫原性
传说:(1)=接种zkv灭活疫苗株SV0010/15;
(2)=已注射佐剂和PBS7.4;
(3)= zkv菌株SV0010/15(同源菌株)中和;
(4)=经ZIKV MR766菌株(异源菌株)中和;
(5)PRNT价值
另外,在第60天和第180天对ZIKV病毒株SV0010/15(同源株)和MR766病毒株(异源株)的中和抗体分别为31、48和14、34(图2)。
集团(1) |
猴子的代码 |
病毒检测(2) |
病毒分离 (病毒滴定)(3) |
病毒血症(天) |
|
我 |
1/1 |
- |
- |
- |
|
1/2 |
- |
- |
- |
||
1/3 |
- |
- |
- |
||
2 |
1/4 |
- |
- |
- |
|
1/5 |
- |
- |
- |
||
1/6 |
- |
- |
- |
||
3(4) |
2/1 |
+ |
+ (2.1 log10) |
183 |
|
2/2 |
+ |
+ (1.8 log10) |
184 |
||
2/3 |
+ |
+ (2.3 log10) |
183 |
表2食蟹猴挑战试验后的病毒检测、分离和滴定
传说:(1)= I组和III组分别用ZIKV菌株SV0010/15(同源菌株)攻毒,II组用ZIKV菌株MR766(异源菌株)攻毒;
(2)RT - PCR检测病毒;
(3)C6/36、IFA病毒分离和空斑法病毒滴定
(4)阳性对照攻毒组;
最终,除了假对照猕猴外,所有接种疫苗的猴子都完全免受两株寨卡病毒的攻击,这从血清样本中没有检测到病毒RNA证明了这一点(表2)。
这些小动物模型的临床前结果表明,寨卡灭活疫苗的安全性(剂量)和免疫原性。在猕猴身上的实验证实了先前在小鼠身上的结果,并可以通过适用于人类的疫苗剂量和给药途径将其扩展到非人类灵长类动物模型。优化后的AlOOH佐剂寨卡疫苗在免疫6个月后对食蟹猕猴两株寨卡病毒均有100%的保护作用。根据局部和全身观察,未见与疫苗相关的特殊不良反应报告[22]。免疫后6个月,所有猕猴均出现血清转换,包括IgG/IgM,中和抗体反应仍可检测到。这种候选疫苗是泰国的第一代寨卡疫苗。此外,它兼容并提供高质量的疫苗。这种新型灭活疫苗质量优良,有潜力开发到GMP试点规模。结合其在动物模型中的优异表现,这表明该疫苗将适合基于公众需求加速开发。
我们要感谢公共卫生部疾病控制流行病学司Rome Buathong博士提供的寨卡病毒株SV0010/15和政府制药组织(GPO)提供的世卫组织Vero细胞,以及一些支持人员和工作人员。此外,作者也感谢分子生物科学疫苗开发中心和马希多大学兽医科学学院的工作人员对该项目的帮助。该项目得到公共卫生部国家疫苗研究所(NVI)的支持。Gonzalez博士得到了ERP国际有限责任公司的支持。
引用:在南美洲圭亚那,在免疫规划中引入肺炎球菌结合疫苗及其对5岁以下死亡率的影响。中国疫苗杂志(第8期)
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